冷藏日本真鲈鱼片优势腐败菌的致腐能力的分离鉴定

互推小编 2024-02-05

日本真鲈，作为良好的营养来源，富含优质蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素及大量矿物质，深受广大消费者喜爱。目前，我国进口日本真鲈常以活鱼和冰鲜鱼的形式销售流通，保鲜期短，且极易造成微生物污染腐败变质，危害人类健康。

有研究表明，鱼类捕获后经三去（去头、去鳞、去内脏）处理可明显减缓鱼肉品质的劣变，降低微生物污染，延长货架期。同时，鱼骨分离既可实现鱼肉加工增值，又可实现鱼骨潜在的功能和经济，实现整鱼的全利用。冷藏保鲜已广泛应用于多种海产鱼类如三文鱼、金枪鱼、鲳鱼、带鱼等的保鲜，实现了巨大的经济效益。因此，对冷藏日本真鲈鱼片品质变化的研究，对满足消费者需求、促进日本真鲈养殖和加工产业的长期健康可持续发展具有重要意义。

日本真鲈24尾，购于山东省青岛市西海岸新区水产批发市场，单尾重量为(900±100)g，活力好，无伤损，经充氧水车运抵后于12㎡鱼池暂养2天左右取样。氯化钠、三氯乙酸、氯化钾、2-硫代巴比妥酸、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、乙醇等，国产分析纯，购于上海国药集团；平板计数琼脂培养基(PCA)，购于青岛海博生物。

日本真鲈敲头致死，三去（去鳞、去内脏、去头）处理后用去离子水洗去余血，取背部鱼片去皮，整形分割成4cm4cm1.5cm左右大小，沥干水分后用无菌真空袋真空包装备用。

将真空包装后样品转移至(4±0.5)°C洁净冰箱中贮藏，在贮藏第0、1天取样后每隔2天取样一次，用于各理化指标测定。

参邹朝阳和潘澜澜等的方法略作修改，由6人组成的评价小组按表2.1的方式对日本真鲈鱼片的感官品质进行评定，取色泽、气味、组织形态、组织弹性四项平均分为综合评分，当感官综合评分低于6分，则判定为鱼片感官不可食用。从鱼片转移至(4±0.5)°C洁净冰箱中贮藏时开始计时（记为第0天），此时的新鲜鱼片感官综合评分记为10分。感官评价从贮藏第1天开始，每隔2天评价1次。

持水力是肌肉组织通过物理方式截留大量水而阻止水分渗出的能力，持水力越大，肌肉组织损伤越小。因此持水力可作为判断鱼类新鲜度的重要指标之一。由图可知，日本真鲈鱼片的持水力在贮藏期间呈下降趋势。在贮藏初期，日本真鲈鱼片的的持水力明显降低，中后期则缓慢降低并趋于平缓或略有上升。这是因为鱼肉在新鲜状态下，组织结构完整，持水力好；随后，鱼肉很快进入僵直阶段，鱼肉组织内生理生化反应加剧，肌肉急剧收缩，持水力迅速下降；随着贮藏时间的延长，鱼肉蛋白分解变性，肌原纤维结构发生破坏，持水力进一步降低；在贮藏后期，鱼肉组织结构破坏严重，鱼肉自身失水增多，离心后的样品水分变化不大甚至减小，故而形成持水力变大的假象。

白度值反映了鱼片的色泽变化，日本真鲈鱼片在冷藏过程中的白度值变化如图所示。随着贮藏时间的延长，冷藏日本真鲈鱼片的白度值呈现上升趋势，这和徐永霞等研究冷藏鲈鱼品质的变化时所得结果一致。在贮藏前期，日本真鲈鱼片的白度缓慢增加；在贮藏中后期，日本真鲈鱼片的白度值迅速增加并保持稳定。

有研究表明，样品对光线的反射程度是引起白度值变化的主要原因，在本研究中，日本真鲈鱼片的持水力随着贮藏时间的延长显著下降，即鱼片表面水分含量增加，从而引起鱼片表面对光的折射增加，使白度值增加；到贮藏末期，日本真鲈鱼片的持水力变化较小，故而白度也基本保持不变。同时，随着贮藏时间的延长，日本真鲈鱼片蛋白质的变性程度增加，形成了不透明的蛋白凝胶，也会使白度值上升。

代谢产生的各种酶进一步分解蛋白质、氨基酸等物质，并生成胺类、醇类、醛类、酸类、硫化物等挥发性化合物，产生令人不快的臭味、异味。因此研究日本真鲈鱼片贮藏过程菌落总数的变化可作为判别鱼肉新鲜度的重要指标之一。日本真鲈鱼片的初始菌落总数为3.59log(CFU)/g，为一级鲜度标准[<4.0log(CFU)/ml]；随着贮藏时间的延长，日本真鲈鱼片的菌落总数呈现上升趋势。在贮藏第9天，日本真鲈鱼片的菌落总数超过二级鲜度标准[6.0log(CFU)/g]，此时可认为该鱼片不可食用，到达货架期终点。

日本真鲈鱼片的感官综合评分随着贮藏时间的延长呈现下降趋势。在贮藏初期，日本真鲈鱼片的组织结构紧密完整，条纹清晰；色泽正常，肌肉切面富有光泽；香味浓郁；富有弹性，综合评分高。随着贮藏时间的延长，日本真鲈鱼片的感官综合评分逐渐降低，这是由于鱼片组织内微生物的大量繁殖、自身内源酶作用、蛋白质变性和持水力降低等综合影响所致。在贮藏第9天，日本真鲈鱼片色泽暗淡、切面无光泽，香味消失、有腥臭味，肌肉组织松散、无弹性，感官综合评分低于6.0分，可认为感官不可接受。综合菌落总数和感官评分结果，可以认为冷藏日本真鲈鱼片在第9天到达货架期终点，即日本真鲈鱼片的货架期为9天，此时间点的日本真鲈鱼片可用于后期的优势腐败菌分离鉴定和优势腐败菌的致腐能力研究。

参考江杨阳等的方法，略做改动。在无菌操作台中，取节货架期终点（第9天）的腐败鱼肉10.0g，用无菌绞肉机绞碎，9倍体积生理盐水制成1:10的菌悬液，梯度稀释后，吸取适宜稀释度的菌悬液0.5mL倾注于多种选择性培养基平板上，混匀、凝固后，分别置于恒温培养箱中培养24~72h。各选择性培养基各稀释梯度3个平行。挑选各选择性培养基中典型菌落，平板划线2~3次，得到纯化的单菌落于-80°C冰箱中保存。

PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为：3μL样品+1%琼脂糖凝胶，Marker条带组成：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp。750bp条带浓度为20ng/ul,显示为加亮带，其余条带浓度均为10ng/ul。

DNA测序：将条带清晰，无明显拖尾的DNA样品送至武汉六合华大进行DNA测序。使用美国国家生物信息中心中的BLAST对各菌株进行序列比对分析，选取同源性在98%以上的序列，利用MEGA8.0软件进行DNA序列对比，构建Neighbor-Joining系统发育树。

鲈鱼样品宰杀后，取鱼片备用。参考赵宏强和李婷婷等的方法略做改动。将制备好的日本真鲈鱼片置于铺有保鲜膜的超净工作台上，用75%的消毒乙醇擦拭鱼片表面3次，待晾干鱼片表面水分后，用无菌水擦拭鱼片表面3次，使乙醇浓度稀释后，再用紫外线照射20min，即得无菌鱼片，经菌落计数后小于2.0log(CFU)/g，则符合实验要求。

制备菌悬液，将分离得到的纯种腐败菌分别接种至营养琼脂中复壮培养，然后挑选各培养皿中的典型菌落于100mL营养肉汤，37°C条件下培养24h，8000r/min离心后弃上清液，用生理盐水调整菌落总数至7.0~8.0log(CFU)/ml范围内，编号备用。将制备好的无菌鱼片，分别浸入编号的菌悬液中，浸泡10s后拿出沥干水分，然后分别放入多个无菌培养皿中并相应编号。

再封上带气孔的无菌保鲜膜，于4°C无菌冰箱恒温培养，并以多块未接种腐败菌的无菌鱼片作空白对照。对各培养基中的鱼片从第1天开始进行感官测定（色泽以切面有无光泽进行评定，其他正常），每隔2天测定一次。将感官腐败较快的日本真鲈鱼片接种的腐败菌作为初筛优势腐败菌，并对其进行理化品质评价和致腐能力研究。

贮藏初期，接种不同腐败菌的日本真鲈鱼片组织结构紧密完整，条纹清晰；色泽正常，肌肉切面富有光泽；有鱼肉特有香味；富有弹性，同未接种腐败菌的日本真鲈鱼片无本质差别。随着贮藏时间的延长，接种不同腐败菌各组鱼片呈现不同程度的的腐败现象。其中，从贮藏第3天开始，部分接种腐败菌如产气肠杆菌(Entero bacteraer ogenes)的日本真鲈鱼片表面变得粘稠、色泽暗淡、弹性降低，腐败程度加剧。

在贮藏第7天，接种产气肠杆菌(Entero bacteraer ogenes)、希瓦氏菌(Shewanella)、沃氏葡萄球菌(Staphy lococcus warneri)和奥斯陆莫拉菌(Moraxellaosloensis)的鱼片样本感官综合评分下降最快，感官综合评分已低于4.0分，鱼片色泽暗淡或呈黄绿色、切面无光泽，具有明显的腥臭味或氨臭味，组织松散且无弹性，鱼片已严重腐败。接种其他4种腐败菌的日本真鲈鱼片虽已腐败但和未接种腐败菌的日本真鲈鱼片感官相差较小。

通过感官结果可知，产气肠杆菌(Entero bacteraer ogenes)、希瓦氏菌(Shewanella)、沃氏葡萄球菌(Staphy lococcus warneri)和奥斯陆莫拉菌(Morax ellao sloensis)四种腐败菌造成日本真鲈鱼片的腐败速度较快，可作为日本真鲈鱼片的初筛优势腐败菌，用于后期优势腐败菌的致腐败的能力测定。

日本真鲈鱼片的各种腐败菌因生长温度的改变在进入较短时间的停滞期后，腐败菌的菌落总数开始缓慢增加；到达贮藏终点时，接种产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、希瓦氏菌(Shewanella)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)和奥斯陆莫拉菌(Moraxellaosloensis)的鱼片菌落总数分别为8.95log(CFU/g)、9.10log(CFU/g)、8.89log(CFU/g)、9.29log(CFU/g)。未接种腐败菌的无菌鱼片菌落总数由贮藏初期的1.88log(CFU/g)到贮藏终点的7.43log(CFU/g)，表现出极强的繁殖能力，这是因为无菌鱼片初期菌落总数较少，微生物菌群间的相互作用较少，故菌落总数随着贮藏时间的延长而显著增加。

通过对4°C冷藏日本真鲈鱼片的优势腐败菌及其致腐能力研究，可为后期人工添加生物抑菌剂来抑制日本真鲈鱼片微生物的生长繁殖，保持鱼片品质、延长货架期提供理论指导。

茶多酚（tea poly phenols），又称茶鞣质、茶单宁，是从茶叶中提取出来的一类多酚类物质的总称，具有抑菌、抗氧化、抗癌等功能，在食品保鲜领域具有广泛的应用。茶多酚分子含有大量的酚羟基，是一种优良的氢或中子给予体，能够与机体内过量的自由基生成稳定的酚氧自由基，减缓自由基链反应，抑制氧化酶系反应，同时还能激活或促进抗氧化酶系的作用、络合金属离子，达到抑制氧化的目的。

茶多酚还对微生物具有高度的选择性，既能抑制百余种有害微生物的生长，又能促进双歧杆菌和乳酸菌等有益微生物的增殖。Li等研究了0.2%的茶多酚溶液浸渍处理对冷藏鲫鱼品质变化的影响，结果表明茶多酚可有效抑制鲫鱼微生物的生长繁殖维持其感官品质，并使其保质期延长6-7天。

Fan等研究了同样浓度茶多酚对冰藏鲢鱼品质的影响，结果显示茶多酚能有效抑制鲢鱼肉微生物的生长和酶的活性、延缓TVB-N增加并延长7天的货架期。Ju等研究了茶多酚对真空包装大口黑鲈贮藏品质的影响，结果表明，茶多酚能有效抑制腐败气味、微生物生长、蛋白分解和脂质氧化，还能改善质地，保持高水平的感官可接受性。可见，茶多酚在日本真鲈鱼片的保鲜领域具有广阔的应用前景。

参考文献：

[1] 鞠健, 胡佳慧, 乔宇, 等. 茶多酚结合真空包装对微冻鲈鱼片品质的影响[J]. 现代食科技, 2018, 34(01):110-116.

[2] 钟智豪. 减菌处理对草鱼片脂肪氧化及蛋白质氧化的影响和控制[D]. 2015.

[3]王田, 贾娜. 植物多酚对肉制品脂肪氧化和蛋白氧化的抑制机理及应用[J]. 中国食品学报, 2016,16(8):205-210.

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