动物源性食品中兽药残留的检测——苯并咪唑类药物残留

互推小编 2023-11-10

苯并咪唑类药物（benzimidazoles，BMZs）是一类含有苯并咪唑结构母核的驱虫类药物。噻苯咪唑thiabendazole，TBZ）是第一个BMZs，自20世纪60年代初问世以来，研究者陆续合成了许多广谱、高效、低毒的抗蠕虫药，主要的药物有甲苯咪唑（mebendazole，MBZ）、芬苯达唑（苯硫咪唑，fenbendazole，FBZ）、阿苯达唑（丙硫丙咪唑，albendazole，ABZ）、丁苯咪唑（帕苯哒唑，parbendazole，PAR）、奥芬达唑（苯亚砜苯咪唑，oxfendazole，OFZ）、奥苯达唑（丙氧苯咪唑，oxibendazole，OXI）、三氯苯咪唑（triclabendazole，TCB）、坎苯哒唑（噻苯咪唑酯，cambendazole，CAM）、氟苯达唑（flubendazole，FLU）、鲁苯达唑（luxabendazole，LUX）、萘托比明（netobimin）、多菌灵（carbendazim，MBC）等。其因具有驱虫谱广、驱虫效果好、毒性低，甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵的作用，被广泛应用于动物寄生虫的治疗，同时还作为杀霉菌剂应用于农产品的储存和运输。

但研究发现，BMZs类部分药物如PAR、CAM、ABZ和OFZ对多种动物体有致畸和胚胎毒性，且对人类也可引起与动物同样的潜在危害。动物不合理使用导致的残留可通过食物链传递作用，最终危害到人类健康。因此，中国、美国、欧盟等大多数国家或组织将其作为食品安全重要的监控对象，并制订了MRL。因此，应加强动物源性食品中BMZs残留检测技术的开发和应用，以保证动物性产品质量安全，维护人体健康。本部分综述了BM2s的理化性质、药理学、危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1 理化性质

BMZs结构中均含有苯并咪唑结构母核，即苯环与咪唑的C4和C5稠合而成的双环体系（图5-49）。根据C2位取代基的不同将BMZs分为氨基甲酸酯类（carbamates）和噻苯咪唑类（thiabendazoles）。母核结构相当稳定，其咪唑部分含有对称的酸性（-NH-）和碱性（=N-）结构，接受质子后可形成稳定的对称共轭酸。苯并咪唑氨基甲酸酯类结构在强酸或强碱和加热条件下可发生水解，生成2-氨基衍生物。含硫的药物如ABZ、FBZ易被氧化生成亚砜或砜。常见BMZs及其代谢物化学结构见图5-50。

BMZs为白色或黄白色结晶粉末，多数熔点在200～300℃，熔化常伴随分解。BMZs基本上属于弱碱性物质，中等极性，在大多数有机溶剂和纯水中难溶，除溶于二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等强极性溶剂外，也可溶于稀无机酸、甲酸和乙酸溶液、强碱性溶液。

2 药理学

BMZs广泛用于驱除各种动物胃肠道寄生虫，其作用基本相似，主要对线虫有较强的驱杀作用，有的不仅对成虫，甚至对幼虫和虫卵都有杀灭作用。由于理化性质和药动学特征的差异，其作用也有不同，如ABZ对绦虫和吸虫有驱杀效果，而TCB则主要用作驱吸虫药。抗虫作用机理是主要与虫体的微管蛋白选择性结合，抑制微管增长，引起微管的损伤，阻止微管组装的聚合，从而影响虫体的消化和营养吸收，干扰虫体的能量代谢。

3 危害

虽然BMZs是广谱、高效、低毒的抗寄生虫药物，但如果连续过量使用，也会引起严重的不良反应，长期使用还有可能引起某些寄生虫耐药性，并能产生交叉耐药。如ABZ、TBZ能使蠕虫产生耐药性，而且有可能对其他BMZs产生交叉耐药现象，对动物的不良反应亦较其他药物严重。最早研究发现PAR对绵羊有致畸作用，此后大量研究资料表明，当高剂量或较长时间使用时，BMZs中的PAR、CAM、ABZ和DFZ对多种动物体有致畸（主要表现为各种骨骼畸形）和胚胎毒性，且绵羊和大鼠比较敏感。动物试验证明ABZ具有胚胎毒性及致畸作用，对妊娠2～4周的绵羊给予ABZ可诱发各种胚胎畸形，应用较大剂量（每天30mg/kg）时，会造成雌大鼠和雌兔胎儿吸收和骨骼畸形等。DFZ治疗量虽对妊娠母羊无胚胎毒性作用，但在妊娠17d时，22.5mg/kg用量对胚胎有毒且有致畸影响。不合理的用药不仅导致耐药性的产生以及致畸和胚胎毒性等不良反应，增加畜牧养殖成本，加大防疫难度，而且会导致动物源性食品中残留蓄积，通过食物链传递作用，对人类也可引起与动物同样的潜在危害。

4 国内外限量要求

为保证消费者使用安全的动物源性食品，包括欧盟、美国和中国在内的大多数国家和组织均已经明确规定了BMZs及其代谢物的MRL标准，具体见表5-33。

欧盟和我国规定ABZ的残留标志物是ABZ以及其代谢物ABZ-2-氨基砜（albendazole-2-aminosulfone，ABZ-NH2-SO2）、阿苯达唑砜（albendazole sulfone，ABZ-SO2）和阿苯达唑亚砜（Albendazole sulfoxide，ABZ-SO）；OFZ、FBZ的残留标志物是它们的代谢物奥芬达唑砜（苯亚砜苯咪唑砜，oxfendazole sulfone，FBZ-SO2）；FLU的残留标志物是其代谢物2-氨基氟苯咪唑（2-amino-flubendazole，FLU-NH2）；MBZ的残留标志物是其等效物羟基甲苯咪唑（5-hydroxymebendazole，MBZ-OH）和氨基甲苯咪唑（mebendazole-amine，MBZ-NH2）；OXI的残留标志物是其原型；TBZ的残留标志物是TBZ及其代谢物5-羟基噻苯咪唑（5-hydroxy-thiabendazole，5-OH-TBZ）。

5 样品处理技术

BMZs为弱碱性化合物，水溶性低，易溶于强酸性溶剂和极性溶剂，因而用强极性溶剂提取和以调节pH为基础的净化与固相萃取是BMZs样品前处理的基本方法，新的净化方法如基质固相分散、超临界流体萃取法、QuEChERS方法等亦有应用。

5.1 提取

BMZs是弱碱性化合物，pH对具有弱碱性物质的溶解性或分配系数影响很大。调节pH使待测组分在水相中处于中性分子状态，或达到两性分子的等电点，水溶性降低，易被有机溶剂如乙酸乙酯、氯仿萃取。用强极性溶剂提取时，样品中加入氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和氨水等碱性溶液，可提高乙酸乙酯的萃取效率。采用乙腈提取时，不仅不需要调节样品/液的pH，还可避免乳化现象，这是由于乙腈具有强的去蛋白能力，能破坏分析物与组织蛋白之间的不可逆结合，从而提高萃取效率。样品中加入无水硫酸钠，亦有利于有机溶剂的提取。

需要注意的是组织样品中BMZs与蛋白结合率高，同时BMZs进入体内后轭合物残留比例较高，不易被有机溶剂提取，需先用β-葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶酶解或用强酸水解后再进行提取。一些BMZs在样品处理过程中易发生氧化损失，可在提取、净化或浓缩环节加入适量的抗氧化剂如二叔丁对甲酚（BHT）或将待测药物氧化后测定砜衍生物。

Cannavan等采用pH7。0的磷酸缓冲液和乙酸乙酯混合液提取牛组织中的TBZ及其主要代谢物5-OH-TBZ。陈毓芳等采用碳酸钾碱化的乙酸乙酯提取动物组织中的OFZ、CAM、ABZ及FBZ。杨方等采用氨水碱化的乙酸乙酯提取鳗中的ABZ。林永辉等用乙酸乙酯-氨水（98∶2，V/V）提取鳗中的6种BMZs（MBZ、ABZ、OXI、OFZ、FLU、FBZ）。林海丹等采用氢氧化钾碱化的乙酸乙酯提取乳粉中的ABZ、TBZ、FBZ、CAM、ABZ-SO25种BMZs。张素霞等、陈莹等和刘勇军等均采用碳酸钠碱化的乙酸乙酯提取组织中的BMZs，不同的是刘勇军等在乙酸乙酯中加入BHT和无水硫酸钠，以抗氧化和盐析，提高回收率。

陈莹等比较了正己烷、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯及加入不同浓度碱性缓冲物质的乙酸乙酯对动物肌肉组织中TBZ、OFZ、MBZ、TCB和FLU提取回收率的影响，结果表明提取5g肌肉中BMZs，采用加入4mL2mol/L碳酸钠的乙酸乙酯提取，BMZs的提取效率较高，且其毒性小。林海丹等分别以20mL乙酸乙酯不加碱液和加0.5mL0.5g/mL氢氧化钾、0.2mL0.5g/mL氢氧化钾、0.4mL0.5g/mL氢氧化钾做对比实验，考察提取溶剂pH对BMZs在动物组织中的提取效率，实验结果表明提取溶剂pH对ABZ、OXI的提取效率无明显影响，随着pH增大，其他BMZs的提取效率提高，但pH太高（较高碱液浓度0.4mL0.5g/mL氢氧化钾）时，CAM、FBZ、FLU、MBZ、FBZ-SO2、TBZ、5-OH-TBZ提取效率下降50%，ABZ-NH2-SO2、ABZ-SO、ABZ-SO2的提取回收率下降至10%以下。

Nakos等用乙腈提取牛奶中的ABZ、OFZ、OXI和TBZ。Fletouris等用3倍体积的乙腈与牛奶样品混合提取牛奶中的FBZ，异辛烷脱脂，二氯甲烷萃取，弃上层水相，有机相用01mol/L磷酸盐缓冲液（pH10）淋洗后蒸干，流动相溶解后用离子对反相液相色谱紫外法测定，方法回收率98%～100%。该方法经改进后可用于牛奶中FBZ、FBZ-SO2、FBZ-SO、p-OH-FBZ的残留分析。付晓芳等采用乙腈高速匀浆提取猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、香肠中ABZ及其代谢物ABZ-NH2-SO2、ABZ-SO2、ABZ-SO。

除了用乙酸乙酯和乙腈提取BMZs外，也有用其他溶剂提取BMZs的报道。如邵俊杰等用碳酸钠碱化样品后，用乙腈-三氯甲烷（10∶1，V/V）提取猪肉中的TBZ。李慧萍等将磷酸盐缓冲液与牛肉混合，煮沸后用1%乙醚提取ABZ、ABZ-SO2和ABZ-SO残留。汤娟等用含1%乙酸的甲醇提取全脂和脱脂奶粉中OFZ、ABZ、FBZ残留。

5.2 净化

动物源性食品样品中一般含有大量的蛋白质、油脂等干扰物，如直接用于分析，不仅仪器检测的背景噪声大，而且会影响色谱柱的使用寿命。为减少干扰和浓缩分析物，需对粗提取液进行净化处理，如液-液萃取、固相萃取、基质固相分散、超临界流体萃取等。有时为达到更好的净化效果，可将上述几种方法结合使用。

5.2.1 液-液萃取（LLE）

LLE是基于分析物在有机相和水相间的分配系数不同，实现杂质与待测药物的分离，从而达到净化的目的。由于BMZs呈弱碱性，通过调节pH使BMZs以中性、阳离子（质子化）或阴离子（酸解离）形式存在。在中性或弱碱性（pH7～10）介质中，BMZs呈中性分子，可以从水相分配到有机相中，常用的有机溶剂有乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯-乙醚和甲苯，使酸性和水溶性杂质留在水相中；而在酸性（pH1～2）介质中则相反，是将脂溶性杂质留在有机相中。乙腈或酸性水相提取液可用正己烷、环己烷和异辛烷洗涤以除去脂类杂质。

Nakos等利用离子对萃取法分离牛奶中的ABZ、OFZ、OXI和TBZ。将样品与3倍体积的乙腈混合，离心去蛋白质，取上清液，加正己烷脱脂，乙腈相蒸干后，加入氯仿和含5mmol/L辛烷磺酸钠的0.1%磷酸溶液，离心取氯仿层，浓缩后RP-HPLC测定。各种待测物的平均回收率70%～94%，检测限1～3μg/kg。

邵俊杰等用乙腈-三氯甲烷（10∶1V/V）提取猪肉中的TBZ，吹干后用2mol/L磷酸溶解残渣，加正己烷采用LLE除脂肪，而后用10mol/L氢氧化钾调pH至8.5±1，再用乙腈-三氯甲烷（10∶1，V/V）反萃取并蒸干，用流动相溶解，HPLC测定。

Capece等将FBZ及亚砜代谢物氧化成FBZ-SO2后测定总残留。1g样品（猪肉、肝、肾、脂肪）与pH8的硼酸盐混合匀浆，加入ABZ-SO2做内标，用乙酸乙酯提取，吹干后残留物溶于二氯甲烷，加入38%高氯酸室温下氧化30min。经饱和碳酸氢钠、乙酸乙酯、正己烷、盐酸系列LLE后，用10mol/L氢氧化钠溶液碱化后再用乙酸乙酯进行LLE，取乙酸乙酯相旋转蒸干后用流动相溶解，HPLC紫外检测法测定，在20～2000μg/kg范围内添加回收率70%～100%，检测限20μg/kg。

陈毓芳等采用甲醇-1mol/L磷酸溶液（1∶1，V/V）与正己烷进行LLE净化动物组织中的4种BMZs，利用正己烷除去脂肪，回收率为74.8%～90.2%。林海丹等将乳粉中残留的BMZs经碱性乙酸乙酯提取后，加入BHT溶液，水浴氮气吹干，用2mol/L磷酸-甲醇（1∶1，V/V）溶解残渣，加正己烷进行LLE，重复2次，下层加水稀释后用OasisHLB固相萃取柱净化，用甲醇洗脱，100μg/kg添加标准水平的样品回收率为71%～90%。张素霞等用酸性乙醇（乙醇∶盐酸＝60∶30，V/V）与正己烷进行LLE脱脂。Dowling等采用正己烷进行LLE脱脂，结合全自动C18固相萃取柱净化，测定了牛肝脏中12种BMZs残留。刘勇军等则用1mol/L磷酸与正己烷进行LLE以除去猪肉中脂类物质。林海丹等采用乙腈-0.1mol/L盐酸-正己烷进行LLE脱脂。

5.2.2 固相萃取（SPE）

SPE是以液相色谱分离机制为基础建立起来的分离和纯化方法，主要用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离、纯化和浓缩。与传统的LLE相比，它能显著减少溶剂用量，简化样品预处理过程，加快样品处理速度，消除某些干扰杂质，避免乳化现象，可实现自动化。目前已报道使用的SPE柱有C2、C18、氨基柱、硅胶、氧化铝、氨基丙基吸附剂、弱阳离子交换柱、强阳离子交换柱等。

Tai等建立了牛奶中TBZ、5-OH-TBZ、FBZ、OFZ的净化方法。将牛奶样品与1mol/L碳酸钠、乙酸乙酯和无水硫酸钠混合匀浆，乙酸乙酯层浓缩后的残渣在1mol/L磷酸和正己烷间分配，弃正己烷层后，水层调pH至8.1±1后用乙酸乙酯萃取，经硅胶柱净化（二氯甲烷淋洗，二氯甲烷-甲醇洗脱），HPLC紫外法测定，方法回收率56%～94%，检测限5～30μg/kg。Steenbaar等将上述方法简化，用于测定鳗肉中MBZ。鳗肌肉组织经碳酸钠处理后用乙酸乙酯提取、正己烷脱脂、硅胶柱净化，用含3%乙酸的甲醇洗脱并吹干，用流动相溶解残余物后进行LC-UV测定，方法检测限为10μg/kg，在10～5000μg/kg浓度范围内，添加回收率大于65%。

Neri等测定了动物源性食品中8种BMZs[ABZ、ABZ-SO2、ABZ-SO、OXI、奥苯达唑ossibendazole）、p-OH-FBZ、FBZ、FLU]残留。采用乙腈超声法提取，蒸发近干，用0.0.05mol/L盐酸溶解，用正己烷进行LLE去脂肪，水相上样至C2柱上，甲醇洗脱并蒸干，磷酸盐缓冲液-乙腈（50∶50，V/V）定容，以苯噻隆为内标，经HPLC-DAD测定，在10～100μg/kg添加范围内，平均回收率为70%～95%。

Dowling等用自动固相萃取仪以C18柱净化牛肝中的12种BMZs张素霞等使用C18柱净化牛肝中的ABZ、TBZ和OFZ，用甲醇洗脱并吹干，用流动相溶解后进行HPLC分析。

杨方等采用乙酸乙酯-氨水作为提取液，提取液蒸干后将剩余的油状物溶于正己烷中，经气基柱净化，用HPLC测定鳗中的MBZ。林永辉用乙酸乙酯-氨水（98∶2，V/V）提取鳗中6种BMZs（BMZ、ABZ、OXI、OFZ、FLU、FBZ）残留，乙酸乙酯旋转蒸干后用正己烷溶解，气基柱净化，正己烷淋洗，甲醇-甲酸（95∶5，V/V）洗脱，加水混匀过膜，进行LC-MS/MS测定。李忠琴亦采用氢基柱净化鳗鲡中MBZ残留。

田德金等用乙酸乙酯提取样品中的药物，提取液浓缩后加入乙腈和正己烷分配脱脂，乙腈吹干后用乙酸乙酯溶解，经中性氧化铝小柱净化，用乙酸乙酯-无水乙醇（4∶1，V/V）混合溶液洗脱。方法的回收率为60%～85%，定量限为1μg/kg。

林海丹等选择OasisHLB净化乳粉5种BMZs，严寒等用OasisHLB净化动物源性食品中ABZ等7种BMZs药物。陈莹等比较了C18柱、氨基柱和OasisHLB柱对动物肌肉组织中BMZs净化效率的影响，结果发现OasisHLB柱的效果较佳。刘勇军比较了HLB柱、SCX柱、C18柱和硅胶柱等净化小柱的净化效果，通过试验发现整体回收率效果是HLB柱＞SCX柱＞C18柱＞硅胶柱。

Chu等使用SCX柱净化牛奶中的ABZ及其残留标志物ABZ-NH2-SO2。牛奶样品加磷酸后于110℃水解，调节pH为5～7后用乙腈提取。样品提取物溶解后，用5mol/L磷酸调节pH为1.5～3.0，样品液过SCX柱，依次用乙腈、乙酸乙酯、甲醇洗涤，20%氨甲醇洗脱，乙酸乙酯萃取后浓缩，进行LC-FLD测定，在待测药物出峰处无干扰，回收率为91.8%～104.1%，检测限为25μg/kg。方忠意、刘琪、吴宁鹏等选用规格60mg/6mL的MCX固相萃取柱分别净化了生鲜奶、猪肝和牛奶中的BMZs。林海丹等选用大体积高容量的规格150mg/6mL的MCX固相萃取柱净化动物组织中16种BMZs，以0.1mol/L盐酸和甲醇为淋洗剂，浓氨水-乙腈溶液（1∶9，V/V）作为洗脱溶剂，添加回收率为81.6%～110%。汤娟等则用PCX阳离子交换柱净化奶粉中3种BMZs。

5.2.3 基质固相分散（MSPD）

MSPD是Barker等在1989年提出并给予理论解释的一种快速样品处理技术，是一种特殊的SPE净化技术，不需要提取、溶剂转换等步骤。基本操作是将样品直接与适量SPE填料一起混合、研磨，使样品均匀分散于固体相颗粒表面，基于固相填料与样品中的目标化合物产生各种作用力，将目标物与样品基质分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。MSPD可同时实现提取与净化，大大节省了时间，减少了溶剂的使用。

Long等用MSPD分离了牛奶中7种BMZs（TBZ、OFZ、p-OH-FBZ、FBZ-SO2、MBZ、ABZ、FBZ）。0.5mL牛奶与2gC18填料混匀装入放有滤板的10mL注射器中，用正己烷淋洗脱脂，挤干后，用二氯甲烷-乙酸乙酯（1∶2，V/V）洗脱，除FBZ回收率为69%稍低外，其他药物回收率均在81%～108%。辛丹敏等采用MSPD提取与LLE净化相结合，研究了奶粉中左旋咪唑和MBZ残留的HPLC法，1.0g奶粉与2gC18填料于玻璃研钵中研磨混匀4～5min，转入放有玻璃纤维滤纸的5mL玻璃注射器中，用正己烷淋洗，真空抽干后，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液减压蒸馏至近约1mL，加入0.1mol/L甲醇混匀，用水饱和的正己烷去脂肪，分析的添加回收率为69.5%～80.1%。

Long等分别建立了猪肉和牛肝中5种BMZs（TBZ、OFZ、MBZ、ABZ、FBZ）的MSPD方法，组织样品与C18填料混匀后装入SPE柱套，用正己烷淋洗，用乙腈洗脱。洗脱液再经氧化铝柱纯化，HPLC-UV内标法检测，牛肝中5种BMZs回收率在55%～93%，猪肉中5种药物回收率在85%以上。张素霞等以MSPD和微体积酸碱萃取净化法为基础，建立了牛肌肉组织中4种BMZs（MBZ、CAM、TBZ、ABZ）的MSPD-HPLC多残留分析法。2gC18填料与0.5g牛肌肉组织研磨混匀装柱，用正己烷淋洗、乙酸乙酯洗脱。洗脱液蒸干后用01mol/L盐酸溶解萃取3次，用氢氧化钠调至pH为12，用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，减压蒸发乙酸乙酯相至近干，残留物用05mL流动相溶解后，进行RP-HPLC测定。Barker等使用硅藻土MSPD和酸/碱LLE方法建立了牛肝中8种BMZs测定的LC-UV方法。Hu等以磁性硅胶聚（甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯）微球为吸附剂建立了猪肉和猪肝中10种BMZs的MSPD净化方法。

5.2.4 超临界流体萃取（SFE）

SFE是利用超临界流体（SF）密度大、黏度低、扩散系数大、兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中的待测物质溶解并从基体中分离出来。它能同时完成萃取和分离两步操作，分离效率高、操作周期短、传质速度快、溶解力强、选择性高、无环境污染。SFE一般以超临界流体二氧化碳为萃取剂。

Danaher等采用超临界流体二氧化碳萃取结合SCX柱净化，研究了绵羊肝脏中的10种BMZs（ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、FBZ、OFZ、FBZ-SO2、MBZ、MBZ-OH、FLU、OXI）残留。烘干的肝脏样品置于萃取皿中，加入1mL水，在温度为80℃、压强为69MPa条件下以二氧化碳超临界流体进行萃取，残留物被富集到一个中性氧化铝柱中，然后采用甲醇-水（6∶4，V/V）洗脱，洗脱液加入冰乙酸酸化，上样至SCX柱进一步净化，用丙酮、甲醇、乙腈各5mL依次淋洗，最终用乙腈-氨水（95∶5，V/V）洗脱，洗脱液吹干后用400μL甲醇-水（5:5，V/V）定容，HPLC-DAD测定，添加浓度在50～500/k范围内回收率为51%～115%，检测限为50/k。

5.2.5 加速溶剂萃取（ASE）

ASE或加压液体萃取（PLE）是在较高的温度（50～200℃）和压强（6895～20684kPa）下用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法。提高的温度能极大地减弱由范德华力、氢键、目标物分子和样品基质活性位置的偶极吸引所引起的相互作用力。液体的溶解能力远大于气体的溶解能力，因此增加萃取池中的压力使溶剂温度高于其常压下的沸点。该方法的优点是有机溶剂用量少、快速、基质影响小、回收率高和重现性好。近年来商品化的ASE仪器在BMZs分析中有所应用，陈冬梅等以ASE200系统建立了猪、牛、羊和鸡的肌肉和肝脏中11种BMZs及ABZ、FBZ、MBZ等10种代谢物的加速溶剂萃取。

5.2.6 QuEChERS方法

Keegan称取牛奶12g，加入含乙腈-硫酸镁-氯化钠的混合物（12∶4∶1，V/W/V）后用手剧烈振荡1min后离心，上清液转入含500mgC18吸附剂和1.5g硫酸镁的离心管中，剧烈振荡后离心，取乙腈层用氮气吹干，用二甲基亚砜溶解，加等量水稀释，混匀后过滤，用缓冲液稀释后用生物传感器法检测牛奶中BMZs残留。刘洪斌等采用正交试验优化的QuEChERS方法处理样品，建立了牛奶中包括原型药物和代谢物在内的12种BMZs兽药残留的HPLC-MS/MS检测方法。量取5g纯牛奶于50mL离心管中，加入20mL0.5%乙酸乙酯溶液、6g硫酸镁、1.5g乙酸钠，剧烈振荡，涡旋2min，5000r/min离心5min，取4mL上清液转入10mL离心管中于45℃条件下氮气吹干，加入2mL甲醇溶解残渣，涡旋1min，超声助溶2min，加入50mgPSA吸附剂，涡旋2min，5000r/min离心10min，取1mL上清液于45℃氮气吹干，再用1mL乙腈-水溶液（3∶7，V/V）定容，过0.45μm滤膜，上机检测。

李锋格等采用QuEChERS方法对鸡肝中8种BMZs及其代谢物（OFZ、FBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2、MBZ、FBZ-SO2）残留提取物进行净化。鸡肝匀浆后，取5.00g于离心管中，加入15mL1%乙酸乙腈振荡提取20min，加入6g无水硫酸钠，混匀后离心，取上清液4.5mL于15mL离心管中，加入200mg氨基（NH2）吸附剂，涡旋2min，离心后取上清液3mL用氮气吹干，加入1mL甲醇-二甲基亚砜-水（10∶50∶40，V/V）溶液溶解残渣，用正己烷除去脂肪，过滤后，进行LC-MS/MS测定。Whelan用改进的QuEChERS方法净化了牛肝、牛肉和牛奶中TCB残留物。Domínguez-Álvarez以聚合物为吸附剂，利用QuEChERS方法对鸡蛋中10种BMZs进行净化，经过富集后用毛细管电泳-质谱法（CE-MS）检测，方法检测限为3～51μg/L，回收率74%～112%。

6 检测技术

6.1 免疫分析法

Nerenberg使用半抗原N-1（3）戊酸基芬苯达唑及其与多聚赖氨酸的结合物制备了抗FBZ多克隆抗体，标记物为5-（4-氘代苯亚磺酰基）芬苯达唑，建立了绵羊脂肪中OFZ残留检测的放射性免疫检测法，方法检测限3μg/kg。Brandon等制备了2-（2-半琥珀酰胺-4-噻唑基）苯并咪唑和5-半琥珀酰胺-2-（4-噻唑基）苯并咪唑两个半抗原，建立了基于单克隆抗体一步竞争法检测牛肝中TBZ的ELISA，检测限低于20μg/kg。Brandon等合成了5（6）-羧基戊硫-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯半抗原，以EDC法合成半抗原与牛血清白蛋白（BSA）的结合物作为免疫原，制备抗BMZs的簇特异性抗体，用直接竞争ELISA测定牛肝中ABZ、FBZ、OFZ及其代谢物，牛肝组织经0.05mol/LpH3。0柠檬酸或纯水提取、中和后测定，ABZ和FBZ的检测限分别为58μg/kg和120μg/kg。Brandon等使用商品化的ELISA试剂盒检测牛肝中的FBZ、OFZ、CAM、TBZ及其代谢物。2002年Brandon等又建立了使用两种单克隆抗体检测牛奶中FBZ的ELISA。

Johnsson用SPR免疫生物传感器检测血清中的BMZsKeegan将牛奶经改进的QuEChERS方法净化后，用SPR生物传感器进行检测，11种BMZs检测限均为5μg/kg，回收率为81%～116%。

6.2 高效液相色谱（HPLC）

HPLC被广泛用于动物组织中BMZs残留分析，大多数采用反相HPLC（RP-HPLC），也有用正相色谱测定血浆中BMZs的报道（表5-34）。

BMZs属于有机碱化合物，水溶性小，在LC中，硅胶基键合相表面残余的带负电荷硅醇基能强烈吸附BMZs，导致保留时间过长、峰拖尾或变形。当流动相为弱酸性或中性（pH5～7）时，BMZs的离子化被抑制，最后出峰的组分保留时间较长，峰展宽严重；当流动相为酸性（pH2～3）时，BMZs的离子化增强，先出峰的组分容易分离，但后出峰的组分严重拖尾。为降低游离硅醇基的吸附作用和增加BMZs在流动相中的溶解性，可采取离子抑制或离子增强的方法来解决。常在测定BMZs的流动相中调节pH及加入离子对试剂、掩蔽剂、盐和较高比例的有机改性剂等来优化流动相，如在酸性流动相中加入四丁基铵阳离子，可改善BMZs的色谱性能，消除峰变形，提高分辨率。常见的流动相体系主要有甲醇-磷酸盐体系和乙腈-磷酸盐体系等。

BMZs及其代谢物的吸收光谱性质相似，在245nm和295nm附近有强的吸收峰，可采用紫外法进行检测。在295nm处摩尔吸收系数相对较低，但干扰少、吸收峰稳定、灵敏度足够，应用较多。对于本身有荧光的化合物如ABZ、TBZ、CAM、LUX及其代谢物，可用荧光法检测，内源性杂质干扰小、检测灵敏度高。

Long等用MSPD分离了牛奶中7种BMZs，用二极管阵列检测器检测，检测波长为290nm。Marti等采用离子对高效液相色谱紫外检测法测定动物肉样中8种BMZs，采用10mmol/L戊烷磺酸盐溶液（含0.5%三乙胺），用乙酸调至pH3.5作为离子对试剂，在298nm处检测，方法检测限为20～50μg/kg。Steenbaar等以LiChrosorbRP-8为色谱柱，以乙腈-0.05mol/L磷酸铵缓冲液（pH6.2）（3∶7，V/V）作为流动相，采用高效液相色谱紫外检测法测定鳗肌肉中的MBZ，检测波长311nm，在10～5000μg/kg浓度范围内添加回收率大于65%。Fletouris等建立了牛奶中10种BMZs（ABZ-NH2-SO2、ABZ-SO、OXI、OFZ、ABZ-SO2、p-OH-FBZ、ABZ、MBZ、FBZ-SO2、FBZ）多残留分析液相色谱紫外检测法。1mL牛奶样品用氢氧化钠溶液碱化到pH为10，用6mL乙酸乙酯提取，分离色谱柱为Nucleosil120C18柱，以乙腈-0.01mol/L磷酸含5mmol/L四丁基硫酸氢铵作为流动相，在292nm处紫外检测，回收率为79%～100%。

张素霞等以乙腈-0.017mol/L磷酸（7∶3，V/V）为流动相，采用C18柱分离，检测波长290nm，在50～400μg/kg添加范围内，4种BMZs的平均回收率为69.2%±12.4%，方法检测限为10～50μg/kg。陈毓芳等利用RP-HPLC-DAD法测定动物组织中4种BMZs残留量，选用DiscoveryC18柱，以0.02mol/LKH2PO4（pH7.0）-甲醇（35∶65，V/V）为流动相，检测波长294nm（ABZ、OFZ及FBZ）和314.5nm（CAM），方法线性范围为0.05～10.00μg/mL，检出限为10μg/kg。张素霞等使用SUPELCOC18柱，以甲醇-磷酸盐缓冲液（60∶40，pH7.0）为流动相分离猪肝中BMZs，在295nm波长处进样检测，方法的平均回收率为78.8%，3种药物的检测限为8μg/kg，定量限为25μg/kg。

Danaher等用超临界萃取提取肝样中13种BMZs，利用HPLC-DAD测定。Dowling等采用HPLC-UV法测定了牛肝中12种BMZs，检测波长298nm，肝脏中添加ABZ-SO、ABZ-SO2、TBZ、OFZ/FBZ-SO、MBZ-OH、FBZ-SO2、OXI、MBZ和FLU的回收率为60%～100%，FLU-NH2和ABZ回收率为50%左右，ABZ-NH2-SO2回收率为25%左右，实验室内变异系数小于25%。空白肝脏和空白肝脏添加12种BMZs的液相色谱图见图5-51。

林海丹等以CloversilC18柱为固定相、甲醇和0.02mol/LKH2PO4为流动相，梯度洗脱，紫外检测器下测定，检测波长为292nm，测定了乳粉中ABZ、TBZ、FBZ、CAM、OFZ等，方法检出限为20μg/kg。张英宣研究了牛肌肉组织中BMZs（ABZ、TBZ和OFZ）多残留HPLC测定方法，方法的线性范围为0.05～3.00μg/mL，回收率为83.6%～90.1%，检出限分别为28μg/kg、12μg/kg、19μg/kg。刘勇军等采用HPLC-PDA法检测猪肉中6种BMZs，以InertsilODS-3C18为色谱柱，以甲醇＋10mmol/L（NH4）3PO4-10mmol/L三乙胺（5∶4∶1，V/V）为流动相，检测波长298nm，柱温30℃，方法检出限20μg/kg，添加回收率68.5%～83.7%。

林海丹等以DiscoveryC18柱为分离柱，以乙腈-0.025mol/L乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长为292nm，外标法峰面积定量。16种BMZs在0.025～1.0mg/L浓度范围内线性良好，方法定量限10μg/kg。

邵俊杰等采用离子对高效液相色谱荧光检测器法测定猪肉中TBZ残留量，采用10mmol/L溴化四丁基铵-0.5%三乙胺，用乙酸调至pH3.5作为离子对试剂，回收率为84.31%～106.87%，检测限为25μg/kg。Arenas等采用液相色谱荧光检测法测定牛奶中的TBZ、5-OH-TBZ和5-OH-TBZ硫酸盐，在0.05～2.00μg/mL浓度范围内，添加回收率为87%～115%。Fletouris等采用离子对高效液相色谱荧光检测器法分别测定了牛奶和奶酪中的ABZ及其代谢物ABZ-SO2、ABZ-SO。Fletouris等又将该法用于动物组织（肌肉、脂肪、肝和肾）中ABZ及其代谢物ABZ-SO2、ABZ-SO的残留检测。

6.3 气相色谱及其与质谱联用分析法（GC及GC-MS）

大部分BMZs极性较高、难以汽化，在进样口高温下分解，直接用GC或GC-MS分析时灵敏度低，因此需要衍生化后再测定。衍生物经GC分离后，可采用电子捕获检测器或质谱检测。少数BMZs如TBZ和TCB可直接用GC检测。含氨（胺）基的BMZs与衍生剂可发生酰化、硅烷化和烷基化反应。常用的酰化衍生剂有三氟乙酸酐（TFAA）、七氟丁酸酐和N-甲基三氟乙酰胺；硅烷化试剂有N-甲基-N-（叔丁基二甲基硅烷基）-三氟乙酰胺（MTBSTFA）；烷基化衍生剂有碘甲烷、溴代五氟苯、N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）。

VandenHeuvel等使用TMAH衍生化，GC-MS选择性离子监测（SIM）测定了牛肌肉和肝脏中TBZ及其主要代谢物5-OH-TBZ。组织样品用β-葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶水解5-OH-TBZ轭合物，样品用乙酸乙酯和01mol/L盐酸反复萃取（浓氨水调pH）及正己烷脱脂净化后进行衍生化，TBZ和5-OH-TBZ分别衍生为N-甲基噻苯达唑和N，O-二甲基羟基噻苯达唑，检测限分别为15μg/kg和25μg/kg。

Wilson等应用毛细管GC-MS，电子轰击离子源（EI）SIM模式确证组织中8种BMZs残留残。留物用两步衍生，用2.0mol/L盐酸在110℃中水解1h，将氨基甲酸酯类转化成2-氨基衍生物；水解产物与MTBSTFA反应，伯胺、仲胺转化生成硅胺衍生物，5-OH-TBZ的酚羟基则衍生成硅醚衍生物。水解CAM相当困难，另采用TMAH甲基化衍生。

Markus和Sherma等建立了牛肝中ABZ的残留标志物ABZ-NH2-SO2的GC-EI（SIM）-MS确证法。样品经过一系列复杂的酸/碱LLE和C18柱净化后，用MTBSTFA进行衍生化，选用特征离子，包括m/z189、m/z354、m/z410和m/z467[M＋]，根据待测物的GC保留时间、特征离子及其丰度进行确证，检测限100μg/kg，方法回收率为73%～105%。

6.4 液相色谱质谱联用分析法（LC-MS、LC-MS/MS）

LC-MS是一种集高效分离、多组分定性和定量于一体的系统，对高沸点、不挥发、热不稳定化合物的分离和鉴定具有独特优势。BMZs在液质中，在正离子电离模式下，一般为[M＋H]＋基峰。BMZs（除前体药物外）均具有苯并咪唑杂环结构，其中大部分（除TBZ、5-OH-TBZ、ABZ-NH2-SO2外）都具有氨基甲酸酯结构，因此在其质谱图中会出现相同的碎片，如质荷比为159和191的碎片离子，因此在选择碎片离子时，除响应值高外，还应当考虑到定性离子对的代表性，然后在MRM模式下优化相应的质谱参数，表5-34列出了动物源性食品中BMZs残留的LC-MS分析条件。

Blanchflower最早将LC-MS用于BMZs的残留确证分析，羊肝或肌肉样品加水匀浆，用甲醇提取离心，用石油醚淋洗后用乙醚-乙酸乙酯（6∶4，V/V）提取吹干，加流动相溶解，LC-MS测定。LC-MS采用热喷雾接口，选择性离子监测，正化学电离方式，FBZ和OFZ的主要离子为[M＋H]＋基峰，分别为m/z300、m/z316。FBZ和OFZ的检测限分别为50μg/kg和100μg/kg，平均回收率分别为91%、86%。

Cannavan等采用液相色谱热喷雾电离质谱，以氘代TBZ为内标，同时测定牛组织中的TBZ和其主要代谢物5-OH-TBZ。组织样品加pH7.0磷酸盐缓冲液匀浆，用乙酸乙酯提取，以氰基柱（CN）净化，梯度洗脱测定，待测物和内标物质子化分子离子[M＋H]＋分别为m/z202、m/z206、m/z218（图5-52），样品阳性结果采用液相色谱-大气压化学电离-质谱（LC-APCI-MS）多离子监测确证（图5-53）。在50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg添加水平中，牛肌肉、肝脏和肾脏中的TBZ回收率为96%～103%，变异系数为0.7%～4.8%；5-OH-TBZ回收率为70%～85%，变异系数为3.1%～11.5%。

Balizs采用LC-MS/MS测定猪组织中的15种BMZs残留（包括FBZ和ABZ的代谢物）。猪肌肉与缓冲液匀浆，用乙酸乙酯萃取和聚苯乙烯-二乙烯苯柱净化后，以2-正丁基硫基苯并咪唑作为内标，梯度洗脱分离，MRM模式监测。方法检出限低于6μg/kg，定量限低于10μg/kg，能够满足欧盟规定的要求。在肌肉组织中平均回收率为50%，在蛋黄中平均回收率为70%。

Takeba等采用乙腈和无水硫酸钠均质提取牛奶中的TCB及其代谢物TCB-SO和TCB-SO2，用乙腈饱和的正己烷进行LLE，蒸干后用0.1mol/L磷酸二氢钾和01mol/L碳酸氢钠溶解，经BondElutC18柱净化，乙腈-0.05mol/L乙酸铵（50∶50，V/V）作为流动相，HPLC-UV（295nm）测定，平均回收率为89.1%～95.0%，检测限为4～6μg/kg，并首次采用液相色谱电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）对奶样中的TCB及其代谢物进行了确证。DeRuyck等报道了羊肌肉和肝脏中MBZ及其代谢物的LC-MS/MS测定方法。方法经过优化，应用于羊口服MBZ后的药物检测，能满足欧盟规定的要求，羊肌肉检出限为10μg/kg。

陈莹等建立了用超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS/MS）同时测定多种BMZs残留量的检测方法。以0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱，质谱条件为:毛细管电压35V；锥孔电压35V；离子源温度100℃；去溶剂温度250℃；碰撞气体为氩气，采用正负离子同时扫描模式，分析过程中以保留时间和2个MRM离子对（1个母离子和2个子离子）进行定性（TBZm/z202.1-m/z131.0和m/z174.9、OFZm/z316.1-m/z191.0和m/z159.0、MBZm/z294.0-m/z156.8和m/z261.9、TCBm/z359.1-m/z344.0和m/z274.1、FLUm/z314.1-m/z122.9和m/z282.0），以峰形佳和响应值高的离子进行定量，优化了二级碰撞能量，方法线性范围1.0～20μg/L；方法检测限:TBZ、OFZ、MBZ、FLU均为01μg/kg，TCB为0.2μg/kg；方法定量限:TBZ、OFZ、MBZ、FLU为0.5μg/kg，TCB为0.7μg/kg。

Stolker等采用超高效液相色谱飞行时间质谱（UPLC-TOF-MS）筛选并定量分析了牛奶中100多种兽药，其中包含17种BMZs及其代谢物，其检测限为2～50μg/L。

方忠意等以ACQUITY UPLCTM BEHC18柱为色谱柱、乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，采用ESI＋模式、MRM模式检测，外标法定量，建立了UPLC-串联四级杆质谱法测定原料奶中7种BMZs（ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2、OFZ、TBZ、5-OH-MBZ）残留量的检测方法。方法检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。林永辉等建立了鳗中6种BMZsLC-MS/MS检测法，以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，质谱条件为ESI＋模式，萃取锥孔电压5.00V，雾化气温度400℃，雾化气流速803L/h，反吹气流速45L/h，离子源温度120℃，毛细管电压2.0kV。方法检测限为2.0μg/kg，回收率为70%～110%。定性离子对:MBZm/z296.0-m/z105.1和m/z264.1、ABZm/z266.0-m/z191.0和m/z234.1、OXIm/z250.1-m/z176.1和m/z218.1、OFZm/z316.1-m/z159.1和m/z191.1、FBZm/z314.0-m/z123.1和m/z282.1、FLUm/z300.1-m/z159.1和m/z268.1。

刘琪等用Waters Xterra C18色谱柱做分离柱，以0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，分别选择母离子及对应的两个响应较强的子离子作为定性依据，外标法定量，建立了猪肝中14种BMZs及其代谢物（ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO、5-OH-TBZ、TBZ、MBZ、MBZ-NH2、MBZ-OH、FBZ、FBZ-SO2、OFZ、FLU、FLU-NH2）残留的HPLC-MS/MS，方法检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg，在10～200μg/kg添加浓度范围内回收率均为70%～120%，空白猪肝添加样品的质量色谱图见图5-54。吴宁鹏等采用UPLC-MS/MSMRM模式检测，外标法定量，建立了牛奶中14种BMZs及其代谢物（TBZ、5-OH-TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-NH2-SO2、ABZ-SO2、OFZ、OXI、TCB、FBZ、FBZ-SO2、MBZ、ALB、FLU）残留的UPLC-MS/MS检测方法，该方法对BMZs及代谢物的检测限均为5μg/kg，定量限均为10μg/kg，在10～200μg/L添加浓度范围内回收率为69.9%～113.1%。

李锋格等采用同位素内标建立了鸡肝中39种药物（含8种BMZs）的UPLC-MS/MS分析方法，以甲醇和甲酸水为流动相进行梯度洗脱，方法的检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。刘洪斌等以AgilentEclipseDB-C18为色谱柱，以乙腈-0.005mol/L甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，建立了牛奶中包括前体药物和代谢物在内的12种BMZs兽药残留的HPLC-MS/MS检测方法。方法在1～500μg/kg范围内线性良好，平均回收率为72.4%～108.3%，检出限低于0.5μg/kg，定量限低于1.5μg/kg。付晓芳等建立同时测定肉中ABZ及其代谢物ABZ-SO2、ABZ-SO、ABZ-NH2-SO2的HPLC-MS/MS。样品用乙腈提取，LLE净化后，XDB-C18色谱柱分离，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶1，V/V），将ABZ及其3种代谢物标准溶液采用流动注射直接进样，通过全扫描方式确定其母离子，再对母离子进行二级质谱扫描得到碎片离子，通过优化条件，得到二级质谱图。通过MRM选择相对丰度较高的离子对为定性定量离子对，并对其去簇电压、碰撞电压等条件进行优化。外标法定量，ABZ及其3种代谢物的检出限均为10μg/kg。

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