盲肠球菌的比较基因组分析，揭示了临床家禽分离株谱系的洲际传播

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埃内科克库克斯是全球家禽的重要病原体。它会导致家禽出现多种运动障碍和败血症，特别是在生长迅速的肉鸡中。

动物的痛苦、抗生素的使用以及相关的经济损失需要更好地理解与埃内科克库克斯相关的疾病分离株。

为了满足这个需求，对法国爆发的大量分离株进行了整个基因组测序和分析。通过提供法国境内流行的埃内科克库克斯分离株的遗传多样性和耐药基因组的第一个数据集。

我们确定了一种可能也在其他地方传播的流行系，应优先针对该流行系采取预防策略，以减轻埃内科克库克斯相关疾病的负担。

一、盲肠球菌对家禽的影响

埃内科克库克斯是成年鸡肠道微生物群的一种共生细菌。在过去的20年里，这种细菌已经成为全球家禽，特别是快速生长的肉鸡，引起运动障碍的重要原因。

在法国，2006年至2018年间的埃内科克库克斯报告显示，埃内科克库克斯引起的感染从总家禽感染中的0.3%增加到了超过7%，其中大多数是肉鸡的运动障碍感染。

埃内科克库克斯主要引起骨髓炎、脊椎炎、椎骨骨关节炎和股骨头坏死，导致由于淘汰、死亡、屠宰厂废弃、兽医费用以及抗生素使用增加而引起肉鸡生产的巨大损失。

埃内科克库克斯感染的发展是多因素的，取决于宿主基因、快速生长、饲料成分、畜牧程序以及动物密度，再加上该细菌的致病潜力。

早期携带埃内科克库克斯并增加感染风险之间的关联表明肠道是感染途径之一。

最近的研究表明，与非临床分离株相比，病变相关的埃内科克库克斯分离株似乎适应了在生命的早期定殖肠道，前者在第3周之前不能以可检测的水平定殖。

还有人提出，消毒失败可能会导致埃内科克库克斯滞留和爆发，因为它可以形成生物膜。尽管基因组中预测了与宿主结合的蛋白质，但对与宿主组织蛋白质的粘附一直被忽视。

埃内科克库克斯生物膜的稳定性和相关特性有待研究。此外，人们认为在革兰氏阳性细菌中，包围胞浆膜的厚层肽聚糖赋予了对血清细菌杀菌活性的抵抗力。

已经使用体内模型在实地条件下比较两个临床分离株的致病性，但仅适用于有限数量的菌株。较不受限制的是鸡胚胎致死性试验，已经显示出致病菌株比共生分离株更高效地杀死。

基于来自美国、加拿大、比利时、荷兰、德国和波兰的共生和临床分离株的脉冲场凝胶电泳模式的多个分子流行病学研究都一致认为，共生分离株的多样性高于临床分离株。

此外，农场和当地区域内基因型相关分离株的多次爆发证实了水平传播和与农场相关的储库。到目前为止，仅有1个完整的和84个部分非冗余的埃内科克库克斯基因组可供使用。

两项关于来自美国的埃内科克库克斯分离株的比较基因组研究。对来自美国东南部的2010年至2011年间分离的三个共生分离株和三个临床分离株的部分基因组进行比较表明。

致病的埃内科克库克斯分离株具有较小的基因组，其中有>120个基因不存在或其产物在共生分离株中的相似性<40%。

另一方面，非临床分离株中约有70个基因在临床分离株中不存在或编码产物的相似性小于60%。

与高临床分离株不能代谢甘露糖的研究一致报告，甘露糖磷酸脱氢酶、甘露糖操纵子以及磷转移酶系统的甘露糖特异性组分IIA的同源物在临床分离株中未被发现。

比较了宾夕法尼亚州2008年和2009年分离的九个临床分离株的部分基因组与2003年至2010年间从国家抗菌药物耐药性监测系统中分离的九个非临床分离株的部分基因组。

证实了临床分离株略小的基因组大小趋势，并且与非临床分离株的更大附件基因组一致。值得注意的是，非临床基因组具有更多的抗生素耐药基因。

通过结合已有的埃内科克库克斯草稿基因组序列，估计核心基因组具有1,436个基因。核心基因组的系统发育分析导致本研究的作者得出结论。

这些分离株独立于它们的临床或非临床状态而成簇，这引发了临床分离株是否属于特定遗传群体的问题。

本研究的目标是更好地了解布列塔尼地区在2007年至2017年间流行的肉鸡E.cecorum临床分离株的基因组组织和表型多样性。

我们对100多个家禽和人类临床分离株进行了整个基因组测序，以更好地定义临床分离株的遗传关联程度，并检测与与致病性相关的基因。

我们通过测试分离株对II型胶原的粘附性、生物膜的稳定性以及在鸡血清中的生长来完成了这一基因组分析。

通过泛基因组分析来研究E.cecorum的总体遗传多样性，特别关注移动遗传元件、抗生素耐药基因以及附件基因和表型特征的全基因组关联研究。

二、E.cecorum临床分离株的遗传联系

E.cecorum已经在全球的家禽中成为一种机会性病原体。本研究展示了在法国主要的商业肉鸡生产区域于2007年至2017年间收集的大量临床E.cecorum分离株的克隆性。

它确定了主要的系统发育分支和亚分支，并首次揭示了来自家禽的临床E.cecorum分离株的洲际克隆性。

与分离株起源显著相关的六个基因可以区分该集合中94%的家禽临床分离株与非临床分离株。

基于新的完整基因组，我们还深入探讨了携带ARGs的E.cecorum的移动遗传元件的多样性。评估物种多样性的一种方法是分析其核心和附属基因组。

尽管由于使用草稿基因组，它们应被视为粗略的估计，但当前的E.cecorum核心基因组仅占总基因组的14.1%，约占E.cecorum平均基因组的50%。

虽然核心基因组的大小在Sharma等人先前报告的范围内，但由于将130个新基因组添加到先前使用的18个基因组中，E.cecorumpangenome现在比先前的估计大35%。

基因组大小的增加对应于每个基因组仅有20个平均基因，低基因发现率可能是由于克隆E.中高比例的临床家禽分离株。

与大量寄主和生活方式多样性相比，小的核心基因组反映了寄主和生活方式的多样性，正如对大肠杆菌和沙门氏菌等两种普遍存在的物种观察到的那样。

它们具有共生或致病的生活方式，其核心基因组分别占总基因组的0.39%和1.9%。相反，高比例的核心基因反映了更为受限的生活方式。

与致病性相关的基因组缩减在许多细菌中都有观察到，包括链球菌和乳链球菌，其基因组大小在具有毒性寄主适应分离株中减小。

尽管较长的E.cecorum基因组属于临床家禽分离株，但不论其临床状态如何，所有家禽分离株的平均基因组大小都相似。

这一观察与先前在美国分离株上进行的两项研究略有不同，在这些研究中，临床分离株的基因组比非临床分离株的基因组要短。

后者很可能是由于所检查的基因组数量较少，并且采样了临床分离株，根据我们的研究结果，所有这些分离株都属于同一的系统发育亚类，即E12。

在当前数据集中，最小的基因组对应于系统发育亚类E11的分离株，而最大的基因组对应于系统发育亚类E4的分离株。

来自美国的临床分离株的系统发育一致性支持两种假设：分离株来自跨大陆传播，或来自不同地区的分离株受到了类似的选择性压力。

尽管通过肉类贸易传播E亚类分离株的假设不太可能，但活动动物的贸易，表面受污染的鸡蛋，或者被野生鸟类传播都有可能促成了这种传播。

第二个假设，虽然不太可能，但是由于养殖条件造成了平行的收敛选择。本研究中的分离株可能并不代表E.cecorum法国临床种群的全部多样性。

然而，它们的时间分布反映了一种特别适应肉鸡的亚类的传播和持久存在，随着一些更成功的亚类随时间的推移而出现。

这在当前数据集中亚类E4在法国和亚类E12在2008年至2010年之间在美国的统治地位中得到了说明。

特定亚类的暂时流通可能是由于自然演化或对养殖实践的修改而引起的自适应变化，但具体原因尚待确定。

尽管频率较低，临床分离株也出现在C和D两个包含非临床分离株并且具有较高多样性的亚类中。值得注意的是，这两个亚类的分离株具有多种抗生素耐药基因。

可能会赋予选择性优势，因此可能在尚待确定的特定条件下对病原潜力产生贡献。需要额外的非临床分离株和来自不同国家以及其他家禽物种和畜牧系统的临床分离株的基因组。

本研究的结果揭示了法国E.cecorum临床分离株的种群状况，并显示了与其他地方的E.cecorum临床分离株的遗传联系。

我们已经表明，基于现有数据，大多数临床禽类分离株在系统发生上与非临床禽类分离株有明显区别，并形成了导致法国以及可能是美国和欧洲E.cecorum爆发的主要亚类。

整合座和基因岛是携带抗菌药物抗性的主要载体。E.cecorum的E亚类似乎已经适应了家禽饲养条件，突显了它作为全球家禽产业新兴威胁的重要性。

三、总结

艾希曼球菌是一种新兴病原体，可导致鸡的骨髓炎、脊柱炎和股骨头坏死，引发动物的痛苦和死亡，并需要在家禽中使用抗生素。

令人矛盾的是，艾希曼球菌是成年鸡的肠道微生物中常见的居民。尽管有证据表明存在具有致病潜力的克隆体，但与与疾病相关的分离株的遗传和表型相关性仍然很少被研究。

在这项研究中，我们测序和分析了100多个分离株的基因组，并表征了这些分离株的表型特征，其中大多数是在过去10年中从16个法国肉鸡养殖场采集的。

我们使用比较基因组学、基因组范围的关联研究以及对血清的敏感性、生物膜形成能力和对鸡II型胶原的粘附能力的测量来识别与临床分离株相关的特征。

我们发现，没有任何测试的表型可以区分分离株的来源或系统发生组。相反，我们发现大多数临床分离株在系统发生上聚集，并且我们的分析选出了六个基因。

可以区分94%与疾病相关的分离株和非疾病相关的分离株。对抗药基因组和移动基因组的分析揭示，多重耐药克隆体属于少数几个系统发生组。

整合共轭元件和基因组岛是抗生素耐药性的主要载体。这项全面的基因组分析表明，与疾病相关的艾希曼球菌克隆主要属于一个系统发生亚类。

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