透明质酸和硫酸软骨素水凝胶的合成、特征和组织工程应用

互推小编 2023-12-09

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基于光交联型透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)和甲基丙烯酸软骨素(CSMA)的水凝胶目前正在研究用于组织工程应用。HAMA和CSMA凝胶具有可调节的特性，例如可调整的机械性能、溶胀特性和酶降解性能。对于HAMA和/或CSMA的共价交联水凝胶的临床前开发的科学研究有哪些？基于此，来自荷兰乌得勒支大学的Tina Vermonden对基于HAMA或CSMA的水凝胶临床转化的下一步提出了建议，并指出了潜在的缺陷。具体地说，描述了获得聚合玻尿酸和硫酸软骨素衍生物不同的合成路线，讨论了合成聚合物的甲基丙烯酸化程度和分子量等重要参数对形成的水凝胶的影响，并总结了表征它们的有用分析技术。此外，还讨论了所形成的水凝胶的特性，包括其酶降解性。最后，总结了这些水凝胶在软骨、心脏再生和高级组织建模等领域的一些最新应用。相关论文“Hyaluronic acid and chondroitin sulfate (meth)acrylate-based hydrogels for tissue engineering: Synthesis, characteristics and pre-clinical evaluation”发表于杂志《Biomaterials》上。

糖胺多聚糖(GAG)是ECM一类重要的聚合物，可以官能化以产生用于组织工程的水凝胶。GAG是一种线性阴离子多糖，广泛存在于ECM中。GAG(或称粘多糖)包括6个成员，即肝素、硫酸肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素以及透明质酸（唯一的无硫GAG）。透明质酸和硫酸软骨素是人体内发现的GAG中占比最大的部分。除透明质酸外，所有的GAG都以共价的形式附着在蛋白质上，称为蛋白聚糖。

一个研究得很好的蛋白多聚糖家族是聚集素样蛋白多糖(图1A)，它们是体内硫酸软骨素的主要来源。聚集素样蛋白多糖由一个核心蛋白(如聚集素或神经多糖)组成，在图中呈深蓝色。具有中心区域fto，其中硫酸软骨素或硫酸角蛋白链(分别为黄色和红色)和一个链接蛋白基序(橙色)，该基序能够通过与羧酸基的静电相互作用和与N-乙酰基的疏水相互作用(淡蓝色)与透明质酸结合。在结构上，HA和CS非常相似。HA(图1B)由重复的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖单元组成，这两个单元通过交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键相连。此外，CS可以以许多不同的方式进行硫化，例如未硫化的软骨素(图1C)。

图1 蛋白多糖、HA、CS结构示意图

本文（1）对含有透明质酸(HA)或硫酸软骨素(CS)糖胺聚糖的水凝胶进行了文献综述，重点是HAMA和CSMA(图2)。（2）综述了甲基丙烯酸酯衍生物多糖的合成和理化性质，并对共价交联水凝胶的酶降解性能进行了研究。（3）讨论了甲基丙烯酸化HA/CS与其他聚合物的结合以及这些水凝胶形成聚合物的应用。

图2 本文内容及其相互影响的示意图概述

1. 透明质酸和硫酸软骨素的光交联物的合成

（1）甲基丙烯酸化透明质酸衍生物的合成

HA链上含有(甲基)丙烯酸酯部分的引入主要发生在HA的两个最活跃的位置：D-葡萄糖醛酸单元的羧基或N-乙酰-D-氨基葡萄糖单元C-6的伯醇基。对应的两个主要反应是酰胺化反应和酯化反应（最常见）（图3A）。

侧基位点	改性基团	反应物
A	伯醇基	甲基丙烯酸酐（MA）
B	伯醇基	甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)
B	羧基	甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)
C	羧基	甲基丙烯酸氨基乙酯(AEMA)
D	伯醇基	甲基丙烯酸氨基乙酯(AEMA)
E	伯醇基	3-氨基丙基甲基丙烯酰胺(APMAm)
F	羧基	己二酸二肼(ADH)/甲基丙烯酸酐（MA）
G	伯醇基	甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)/琥珀酸酐
H	伯醇基	HA-TBA盐、甲基丙烯酸酐（MA）
I	羧基	甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)
J	伯醇基	HA-TBA盐、己二酸二乙烯酯和脂肪酶

到目前为止，合成HAMA最常用的路线包括与甲基丙烯酸酐的反应或与甲基丙烯酸缩水甘油酯的反应。

图3 用于水凝胶制造的HA和相应的接枝的可光聚合(甲基)丙烯酸酯侧基示意图

（2）甲基丙烯酸化硫酸软骨素衍生物的合成

CS主要是通过含有甲基丙烯酸酯的官能团进行衍生化，以生成适合于光引发交联用于水凝胶制备的大分子单体。根据硫酸盐基团的位置，CS有几种异构体。最常见的是软骨素4-硫酸盐(CS-4)，如图4(左)所示，其硫酸盐基团在C-4位，伯羟基在C-6位可用于化学衍生化。另一种常用的异构体是6-硫酸软骨素(CS-6)，如图4(右)所示。在这种聚合物中，C-6上的伯羟基不能用于官能化，尽管仲羟基也可能是反应性的。因此，有关CS的甲基丙烯化合成反应的研究大多采用CS-4-硫酸盐。此外，D-葡萄糖醛酸基的羧酸基是另一个可用于CS衍生化的反应部位。

图4 CS最常见异构体的分子结构，包括CS-4(左)和CS-6(右)

侧基位点	改性基团	反应物
A	伯羟基	甲基丙烯酸酐（MA）
B	伯羟基	甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)
C	羧基	甲基丙烯酸氨基乙酯(AEMA)
D	羧基	3-氨基丙基甲基丙烯酰胺(APMAm)
E	羧基	己二酸二肼(ADH)/甲基丙烯酸酐（MA）

从报道的制备CSMA的文献实例来看，显然甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸酸酐是制备甲基丙烯酸酯CS最常用的两种方法。

图5 用于水凝胶制备的CS-4和相应的接枝光聚合(甲基)丙烯酸酯侧基的示意图表示

2. HA, CS及其光交联衍生物的表征

在(甲基)丙烯酸化前后对HA和CS进行适当的物理化学表征，对于控制和理解水凝胶的溶胀、刚度、网络密度、孔径和酶降解性等特性至关重要。因此，研究对合成的HAMA和CSMA的分子量和甲基丙烯酸化程度(DM)等重要参数进行验证的分析技术至关重要。讨论了确定HAMA/CSMA数和重量平均分子量(Mn和Mw)、分子量分布和硫酸化(模式)的几种方法。此外，还提出并讨论了几种确定DM的方法。

（1）(甲基)丙烯酸化HA和CS分子量的测定

HA和CS的分子量及其分布取决于材料的来源。对于HA，市场上可以买到分子量在1-2000 kDa范围内的产品，并且具有足够的可重复性，多分散度相对较低。对于CS，可用分子量的范围要小得多，从2到60 kDa。相比之下，从人体关节软骨中提取的CS的平均分子量为~ 16-22 kDa，这表明市上可用的CS产品与天然存在的CS相似。

测定HA(MA)/CS(MA)绝对分子量和分子量分布的方法包括光散射技术，如多角度激光散射(MALLS)。平均聚合物相对分子量也可以使用水相凝胶渗透色谱法(例如使用基于右旋糖酐的校准)获得。其他方法包括：渗透测定法、粘度测定法、分析离心法和低角度激光散射法。

（2）CS硫酸盐化模式的测定

CS是一种异质聚合物，由于其不同的硫酸化模式取决于多种因素，包括动物的类型，组织和提取CS的动物的条件。一般来说，CSMA链上每个重复双糖单元上的硫酸盐基的平均数量会影响形成的水凝胶的溶胀能力。

6-与4-硫酸化CS的比例可以通过13C NMR测量确定，也可以通过使用软骨素酶ABC进行酶降解来确定CS的双糖组成，然后使用色谱、质谱或毛细管电泳等方法对不同双糖的形成量进行定量。

（3）合成的HAMA和CSMA(甲基)丙烯酸化程度的测定

HAMA和CSMA的DM是一个重要参数，因为它影响所制备水凝胶的溶胀容量、网络密度和力学性能。目前，测定HAMA和CSMA甲基丙烯酸化程度最常用的分析方法是1H- NMR分析。当应用于高分子量聚合物时，这种技术会出现问题。可以采取几个步骤来提高质子迁移率并降低测量的实验误差，包括提高溶液温度、测量前用HA降解酶解聚以及增加D2O溶液的离子强度。另一种用于测定HAMA和CSMA的DM的技术是通过高效液相色谱分析，通过将MA与HA/CS连接的酯键水解后形成的甲基丙烯酸定量。该HPLC方法已被证明具有良好的重现性和准确性(典型标准偏差<1%)，并且可以测定DM，而不考虑所使用聚合物的Mw。

3. 基于HAMA和CSMA的水凝胶的形成与表征

由HAMA或CSMA形成的水凝胶是通过这些(甲基)丙烯酸聚合物的共价交联完成的。聚合物结合(甲基)丙烯酸酯基团的自由基聚合是通过热或光照射引起的。决定这种光引发反应效率的因素包括使用的光波长和强度、使用的光引发剂的类型和浓度以及样品中存在的氧或其他自由基清除分子的浓度。本文介绍了量化交联效率和自由基聚合后甲基丙烯酸酯转化的方法，以及聚合物特性对水凝胶性能的影响。

（1）甲基丙烯酸酯交联效率测定

据报道，在光引发剂的存在下，紫外线照射下HAMA或CSMA基水凝胶的典型甲基丙烯酸酯转化率在~ 90%至98%之间。甲基丙烯酸酯转化率的测定可以采用与DM相似的方法进行。形成的水凝胶中存在的未反应甲基丙烯酸酯也可以通过FT-IR分析进行半定量测定。

（2）聚合物特性对水凝胶性能的影响

①将Abbadessa等人报告的CSMA水凝胶的溶胀度与Oudhoorn等人研究中关于HAMA水凝胶的数据进行比较时，观察到CSMA水凝胶比HAMA水凝胶具有更高的平衡溶胀度。

②对于基于共价连接的HAMA或CSMA聚合物的聚合物网络的水解敏感性。研究发现，GMA或MA衍生的纯CS水凝胶在生理缓冲液(pH 7.4, 37℃)中2-25天后降解，并呈交联密度依赖性；HAMA水凝胶在相同条件下可在50天内保持稳定。

③在CSMA中发现的硫酸化程度和模式也在ECM中存在的结合(带正电荷)生长因子和其他可溶性信号分子的潜力中起着重要作用，可以极大地影响植入这种水凝胶的细胞的反应。Lim等人评估了CSMA和去硫甲基丙烯酸软骨素水凝胶对组蛋白保留和包膜人间充质干细胞软骨分化的影响。甲基丙烯酸软骨素水凝胶包封细胞21天后，与CSMA包封细胞相比，II型胶原蛋白和聚集蛋白基因表达明显上调。

4. (交联)HA(MA)和CS(MA)的酶降解

（1）可溶性HA和CS的清除率

HA的清除率在很大程度上取决于注射部位，注射到人体皮肤中的HA的半衰期为1 - 2天。当直接注射到人血液中时，半衰期为2-6分钟。体内静脉注射游离CS的清除率与HA非常相似。

（2）HA和CS的分解代谢

酶降解HA和CS的完整分解代谢途径尚未完全了解。有两种重要的HA/CS降解酶都属于同一家族:透明质酸酶1型和2型(分别缩写为HYAL1和HYAL2)。HYAL1和HYAL2在酸性环境中具有最高的酶活性，主要存在于细胞的溶酶体中，HYAL2也存在于细胞表面。它们通过介导HA/CS片段内吞作用的膜受体协助降解HA和CS。一般提出的通过HYALs降解HA/CS的机制是通过“双置换”机制，其中单个谷氨酸和几个有助于定位底物的残基形成活性位点(见图6)。

图6 提出的HYAL 类型1酶降解HAMA和CSMA的机理

酶降解HA/CS有三个可能的位置，分别是ECM、细胞表面和细胞溶酶体(图7ABC)。

图7 匹配酶降解HA/CS的三种可能途径

（3）甲基丙烯酸HA/CS的酶降解及其水凝胶网络

到目前为止，还没有对由HAMA或CSMA组成的水凝胶进行人体试验，因此没有关于这些材料在人体中可降解性的信息。通常，水凝胶有两种不同的降解机制，整体降解和基于侵蚀的降解。随着降解的发生，整体降解通常表现为水凝胶湿重和溶胀比随时间的增加，最终导致凝胶完全液化。在基于侵蚀的降解中，酶的水动力直径大于水凝胶的平均网格尺寸，只允许酶的作用发生在水凝胶的外缘。

（4）临床转化用HAMA和CSMA水凝胶的酶降解性考虑

适用于所有受酶降解影响的植入材料的一点是，组织中的酶活性取决于组织类型、疾病状态、炎症事件和患者。不同的HA/CS降解酶具有pH依赖性的活性谱，理想情况下，酶降解测试的pH值应与目标组织的pH值相似，通常为pH 7.4。当将细胞包封到HAMA/CSMA水凝胶中时，还应测试这些细胞降解水凝胶的能力，因为大多数细胞表面都存在HA/CS降解酶。用于体外水凝胶降解性测试的酶的选择应基于预期的应用和将在其中注入/植入水凝胶的组织。

5. 基于HAMA或CSMA的复合材料和混合材料用于组织工程应用

（1）基于HAMA的混合水凝胶

Eke等人开发了一种含有脂肪来源干细胞(ADSCs)的GelMA/HAMA杂化水凝胶，用于刺激伤口愈合(图8A)。Hjortnaes等人利用HAMA/GelMA杂化水凝胶研究了导致瓣膜疾病的机制(图8B)。Zhu等报道了一种HAMA与甲基丙烯酸甲醚聚乙二醇制备水凝胶的方法(图8D)，这种水凝胶用于伤口愈合，包括止血(止血)和抗菌性能。Zhang等制备了基于HAMA和CNTs的纳米复合水凝胶(图8C)。

图8 基于HAMA的杂化和复合水凝胶的例子

（2）基于CSMA的混合水凝胶

Zhu等人将可光交联的HA和CS与I型胶原结合，制备了一种模拟ECM的水凝胶支架(图9A)，结果表明，CSMA联合HAMA可促进蛋白多糖的沉积，而与HAMA水凝胶相比，hMSCs的钙化被抑制。在Kim等人的工作中，CSMA和PEGDA被用于开发混合水凝胶，并作为骨组织工程的生物矿化支架进行了测试(图9B)。Silva等人在CSMA水凝胶中加入铁基磁性纳米颗粒(6.9±1.9 nm)制备了一种多功能复合凝胶(图9C)。