新的分离培养方法，能否将海洋微型生物作为新的自然资源利用

互推小编 2024-01-01

文/兰子记

编/兰子记

前言

海洋微型生物不仅是地球上最丰富的、尚未有效开发的自然资源，还是参与全球变化和物质循环的关键组分"。

在过去 25年中，科学家们花费了大量的人力、物力去研究海洋微型生物的种类、数量和分布。

海洋微型生物的种类繁多，并且生物量巨大，每毫升海水中含有的微型生物数量可达一百万个以上。

海洋微型生物在海洋食物链和生物地球化学循环中有着重要作用。

随着对海洋微型生物研究的不断深入，新的问题不断产生。

在不同的环境梯度下，哪些类群的微型生物是优势类群?微型生物的代谢特征对外界环境条件和微型生物类群的变化有着怎样的响应?

不同功能类群的微型生物在海洋生源要素循环中发挥着怎样的作用?

认识微型生物最初的途径和直接的手段是通过分离并培养纯株系并在此基础上进行实验研究。

然而限于条件，目前只有不到1%的海洋微型生物可以培养，分离培养技术成为进行海洋科学基础研究和资源开发的一个瓶颈。

因此，采用新的研究分析手段，如新的分离培养方法，不依赖于培养的分子生物学分析方法，以及目前火热开展的环境基因组学研究。

这些将是揭开海洋微型生物多样性之谜、认识其在海洋生态系统的结构与功能的钥匙。

基于分离培养方法研究海洋微型生物

直接分离培养是利用不同营养组分(碳、氮、硫、磷、维生素、微量元素等)组合的培养基来富集海洋中的微型生物。

直接分离培养法是研究和描述海洋微型生物特性的一个重要手段。

例如，对海洋中最重要的初级生产力行使者之一——原绿球藻的不同生态型分离株系的比较研究中，获得了原绿球藻对环境梯度的响应规律。

然而，由于对海洋微型生物认知的局限性，我们还不能组合合适的培养基以及模拟自然海水中的各种环境因子用于分离培养所有的海洋微型生物。

采用传统的平板分离方法只能培养中海水细菌总数的0.001%~0.1%。

因此培养技术的缺陷是进行海洋科学基础研究和资源开发的一个瓶颈。

最近几年，新开发的分离培养方法在一些海洋微型生物重要类群的分离工作中发挥了重要作用。

例如基于极限稀释培养法(Extinction Dilution Technique)的一种高通量分离培养方法。

此方法是根据待分离海水中的微型生物数目，用灭菌原位海水将待分离海水稀释至每毫升1~5个微型生物，在多孔板上培养一段时间后，显微镜检阳性生长的微型生物数量。

通过这种方法，科学家们新获得了大约2500株菌，包括传统分离培养方法无法获得的一些细菌类群如SAR11、OM43、SAR92以及OM60/OM241(系统发育分类单元)等。

使用该方法分离培养获得的微型生物比例最高可达 14%，与传统的平板分离培养方法相比，提高了约14~1400 倍。

此外，通过单细胞胶囊化技术和流式细胞仪分选技术相结合的高通量筛选方法在海洋微型生物的分离培养研究中也获得了较好的效果。

该筛选方法通过取一定细胞浓度的海水(每毫升100万个)，加入琼脂糖和乳化液，用乳化技术产生凝胶微滴，其中10%左右的凝胶微滴包裹着单个细胞。

通过层析去除未被胶囊化的细胞，培养胶囊化的细胞。采用流式细胞将增殖的凝胶微滴分选到96孔板上得到纯培养株系。

通过这种方法分离到了多种类群的海洋细菌，如a-、B-、y-、浮霉状菌和嗜纤维菌-黄杆菌-拟杆菌(Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides，CFB)等海洋微型生物重要类群。

微型生物纯系的分离培养为海洋微型生物的研究提供了模式对象，但也存在很多的缺陷。

分离培养工作无法描述微型生物在生态过程中的整体作用。人工培养条件无法模拟自然海水中各种参数的细微变化。

而纯系培养过程中无法研究微型生物在整个地球化学循环中的作用模式。

更重要的是，目前绝大部分海洋微型生物是无法培养的。

因此，发展不依赖于培养技术的微型生物遗传多样性研究和宏基因组学研究，为深入揭示海洋微型生物的群落动态和微型生物在海洋生物地球化学循环中的作用提供了可靠的技术前提。

基于16S rRNA基因序列的微型生物群落多样性研究

微型生物群落的组成复杂，多样性极高，并且群落组成随着环境因子的变化而变化。

因此传统的分离培养方法在研究微型生物群落多样性中的有着很大缺陷。

目前海洋微型生物生态学常用基于核糖体小亚基编码基因——16S rRNA 基因序列分析方法。

16S rRNA基因序列在微型生物的不同种之间是高度保守的，是原核微型生物最常用的遗传标记物之一，是了解微型生物的时空分布的生物学基础。

将微型生物群落的总基因提取后，通过特异的引物将携带样品中所有微型生物遗传信息的16S rRNA基因扩增出来，并根据研究目的进而采用不同手段进行分析。

例如:①对获得的16S rRNA基因进行克隆、测序。

②指纹图谱技术，如限制性片段多态性分析(RFLP)/末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)/温度梯度凝胶电泳(TGGE)。

对扩增获得的16S rRNA基因片段进行比较、鉴别，基于DNA序列的微型生物群落多样性研究方法，为鉴别不可培养和低丰度的微型生物提供了可能。

能够全面的反映微型生物群落的组成，从而为探究不同环境条件下的微型生物群落的组成规律和不同微型生物类群之间的相互作用提供了条件。

基于16S rRNA基因序列的分析研究为揭示“不可培养”的微型生物类群提供了有力工具。

然而该技术并不能提供微型生物种群组成结构以外的信息，如生理代谢机制、环境适应机制以及进化机制等。

宏基因组学(Metagenomics)研究

宏基因组是由Handelsman等于1998年首先提出的概念，指以类似于个体基因组分析方法来研究环境中获得的所有基因。

微型生物宏基因组研究是不依赖于分离和培养技术，通过应用现代遗传学分析技术对环境中的微生物种群进行直接的研究。

具体来说，宏基因组学是一种以环境样品中的微型生物群体基因组为研究对象。

以功能基因筛选和测序分析为研究手段;以微型生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的联系为研究目标的新型微型生物研究方法。

宏基因组学研究的流程为，①一般包括从环境样品中提取微型生物的基因组DNA。

②克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，构建基因组文库。

③筛选目的转化子并进行基因测序和功能分析。

通过微型生物宏基因组的分析研究，不仅可以获得环境样品中微型生物群落的组成信息，还可以通过探针来寻找感兴趣的功能基因或探索未知的基因。

该技术大大推动了研究人员对海洋微型生物多样性、微型生物种群间的相互作用、微型生物的进化历史及环境适应机制的了解。

宏基因组技术的应用不断地给研究人员带来新的“惊喜”。例如海水中一类光驱动的质子泵——视紫质蛋白的发现。

研究人员通过对不同水体微型生物宏基因组的研究发现了视紫质蛋白的广泛分布，并证实它们是海洋真光层中能流的一种重要的驱动机制。

另一个重要的发现是古菌氨氧化作用，以往的观点认为细菌是好氧氨氧化作用的主要承担者，然而在许多生境中细菌的生物量与氨氧化作用大小并不对应。

通过宏基因组研究中发现了与古菌16SrRNA基因相邻的氨单加氧酶编码基因，从而得出在海洋生态系统中古菌才是氨氧化作用的主要执行者的结论。

宏基因组学能够对环境微型生物群落结构的真实准确的分析，并能够提供微型生物的潜在功能方面的信息。

理论上来说，任何环境样品，只要能够提取DNA，均能够进行宏基因组的分析。

展望

目前人类正处在气候急剧变化的严峻时期，工业革命以来的人类活动引起的气候变化对海洋造成了温度升高、海水酸化、分层现象加剧等效应。

另一方面，海洋生态系统能够重新分配陆地产生的热量，影响全球气候。

微型生物是海洋中能流和碳流循环的重要执行者。

因此研究气候变化对大空间尺度范围(um~km)内海洋微型生物代谢过程的影响，以及由此造成的反馈效应是本世纪海洋学研究的一个重大挑战。

宏基因组学研究过程能够全面的反映海洋环境变化下的功能微型生物的响应情况。

通过构建海洋微型生物群落对气候变化的响应模型，能够为预测海洋环境的变化提供正确的支持。

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