探讨新型真菌木霉FbMi6对南方根瘤线虫在生物防控应用的潜能

文字/渔夫Talk

编辑/渔夫Talk

引言

根结线虫(Meloidogyne incognita)是世界上危害蔬菜作物最严重的害虫之一，对根结线虫的防控目前仍停留在杀虫剂的阶段，然而持续使用杀虫剂代价高昂，且对人类和环境健康有着不可估量的严重影响。

为了尽量减少杀虫剂的使用，需要对线虫进行生态可持续性综合管理，本次实验提出假设：

根据以往的研究，已知木霉是一种防治根结线虫的拮抗真菌，其中的FbMi6被鉴定为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)。

在此基础上，探讨其对于黑线蛾在根结线虫的生物防治中如何发挥效用。

在盆栽和田间条件下分别单独和联合检测棘孢木霉菌FbMi6，并与对照进行比较后我们发现，棘孢木霉菌FbMi6具有较强的杀线虫活性，能抑制黑纹夜蛾虫卵的孵化率(96.6%)和幼虫的死亡率(90.3%)。

一、基于秋葵培植前提下的曲霉分离物研究背景与实验目的介绍

秋葵(Abelmoschus esculentus L.)是热带和亚热带地区广受欢迎的蔬菜作物。

在印度地区，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)对秋葵造成严重的根系损害，造成印度蔬菜作物19.6%的产量损失。

在印度，目前不建议使用杀线虫剂,木霉是一种潜在的生物防治剂，已成功地应用于蔬菜作物中防治根结线虫。

木霉具有不同的植物健康益处，如促进植物生长、控制疾病、抗逆性和植物抗性的发展。

曲霉木霉(Trichoderma asperellum)是一种新兴的、有效的生物防治剂，因为它在控制植物寄生线虫和与其他继发病原体的疾病复合物方面具有无限的有效性。

植物寄生线虫可被用作生物防治剂的各种木霉抑制:包括竞争、抗生素、抗性和植物对生物和非生物胁迫的耐受性，以及对病原体防御的刺激。

木霉的繁殖速度比其他微生物/生物制剂快，在多样化环境中具有较强的适应能力，通过与植物相互作用时释放激发子，促进植物对病虫害的系统获得性抗性和免疫。

木霉产生的初级和次级代谢物可以抑制植物病原体，木霉产生的许多次级代谢物，如黄酮类化合物和酚类物质对生物胁迫具有抗性(22,23)。

鉴于这个理论基础，本实验在秋葵的体外和体内条件下对土生木霉FbMi6菌株进行有效性测试。

二、生物制剂的分离、鉴定、维护与实验方法

采用连续稀释法(56)将分离的木霉分离到含有50 μg(−1)链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养板上，并在BOD培养箱中于25±2℃的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)上进行增殖。

根据生长模式和菌落颜色等形态学参数对木霉分离物进行属级鉴定，从培养板中分离出纯基因组DNA，利用引物ITS4和ITS5有效扩增ITS-rDNA部分基因。

为了确定鉴定，将序列数据与可公开访问的序列进行比对。

获得隐殖夜蛾卵和第二阶段幼虫

从受感染的茄子(Solanum melongena L.)上的纯种群中，用次氯酸钠法从茄子根部采集虫卵，采用cobb法和改进的Baermann漏斗法(MBFT)提取幼体。

体外试验

培养液100 mL在1500 rpm下离心20 min，每管含有1 × 10(8)个孢子(CFU mL(−1))。

无细胞培养滤液通过0.45 μm过滤器回收，使用PDA电镀程序检查培养滤液是否存在任何真菌孢子。

将5个表面消过毒的卵块分别置于浓度为20%、40%、60%和80%的组织培养板中，以蒸馏水和PDB为对照。

在立体双筒显微镜下，隔天至10天对孵化的幼虫进行计数，计算孵化抑制率。

以水和PDB为对照，用5 mL不同浓度(20%、40%、60%和80%)的培养滤液在组织培养板上进行幼虫死亡率测定。

所有孵化和死亡实验重复2次，实验在室温(25±2℃)下进行。

筛选室试验

1吨印楝饼(有机碳- 10.45%，氮- 0.84%，磷- 0.69%，钾- 0.59%)用3升曲菌FbMi6水溶液富集。

播种前，在实验盆内灌入富含木霉FbMi6的印楝饼，在完全随机设计(CRD)中，每组重复5次。

播种时，在蒸汽灭菌的土壤中接种新孵化的虫卵。

在收获时(播种后45 d)测定秋葵株高、鲜梢和根重、干梢和根重、单株线虫瘿数、单株卵质量、卵质量/卵质量、每200cc土壤第二阶段幼虫数，用手摇透镜计数虫瘿和虫卵，并用Cobb筛法处理土壤。

在热风烘箱中干燥后，记录秋葵的生理生化特性，测定总酚含量。

田间试验评价

播种前15天，将田间研究地块(5 × 3 m(2))与富含T. asperellum FbMi6的印楝饼(CFU 8 × 10(8) ml(−1))混合。

采用印楝饼1吨ha(−1)、含T. asperellum FbMi 6的印楝饼1吨ha(−1)、化学检查(33 kg Furadan 3G ha(−1))和接种对照。

在播种90 d后记录根瘿指数和最终线虫数量，并对秋葵产量和根瘿指数进行测定记录。

三、分离物FbMi6形态和分子鉴定、不同实验条件下观测结果的分析与讨论

在第7天，FbMi-6的形态观察显示，菌丝体发育蓬松，菌落外围有较大的分生孢子带，在产孢后，白色或黄色的生长变成绿色或淡绿色特征，被鉴定为木霉。

分离物FbMi-6的形态特征如下：

如菌丝宽达7.45µm，分生孢子最大长度为3.2 × 197.3µm，衣孢子直径可达9 × 10.4µm，测得的philalides大小为1.7-2.8 × 9.0-16.5µm, philalo孢子直径为2.7-3.2 × 3.4-4.4µm。

根据形态学和分子特征，鉴定分离物FbMi6为T. asperellum可得知，它与T. asperellum的相似性为100%，FbMi6与木霉(T. asperellum)的亲缘关系最为密切。

与对照相比，FbMi6显著降低了根结线虫的孵化率，幼虫死亡率最高。

与对照相比，木霉FbMi6在所有浓度下均能抑制卵的孵化，80%浓度的木霉FbMi6对120 h卵的孵化抑制率最高，可达96.6%。

随着暴露时间的延长，卵孵化抑制逐渐增强，在所有浓度下，木霉FbMi6培养滤液在24 h开始引起卵变形和孵化抑制。

我们还观测到，木霉FbMi6培养滤液在所有浓度下都对线虫幼虫表现出拮抗或杀线虫活性。

与对照相比，木霉FbMi6在80%浓度下木霉FbMi6幼虫死亡率最高(90.3%)，幼虫的死亡率随着暴露时间的增加成正相关态势。

含木霉FbMi6的印楝饼对秋葵黑僵菌及营养生长的影响

在土壤、虫瘿和虫卵株数方面，投放含FbMi6的印楝饼对秋葵种群有显著的促进营养生长效果。

据观测，投放含有木霉FbMi6印楝饼的实验组中，秋葵根部的瘿数量明显减少，富含FbMi6的印楝饼处理的虫卵质量和每虫卵质量均低于对照。

结果数据表明，随着添加剂量的增加，富FbMi6的印楝饼的干根和干梢质量最大。

田间条件下，木霉FbMi6对根结线虫侵染秋葵生长和产量的影响

我们发现在田间试验中，施用富FbMi6的印楝饼可显著提高产量，降低线虫数量。

而经呋喃处理的田块中线虫繁殖率低于富FbMi6的田块，与对照相比，含有FbMi6的木霉对印楝饼和呋喃的根瘿有抑制作用，施用富FbMi6的苦荞麦饼和呋喃丹可显著减少土壤线虫数量(第二阶段幼虫)。

包括美国、澳大利亚、印度和中国在内的许多国家最近都逐步开展木霉来源的收集，木霉的研究最初集中在土壤动植物、土壤修复、土壤生物学、污染和一般真菌学等方面。

随着人们对木霉认识的加深，研究人员开始关注木霉的生物防治及其在植物线虫学和真菌学中的应用。

我们本次实验中使用的分离物FbMi6经培养、形态学和分子鉴定为木霉，木霉FbMi6具有明显的拮抗作用，表明其可能含有线虫毒物质。

木霉FbMi6产生的线虫致死化学物质似乎在线虫死亡中起关键作用，使用木霉作为生物防治剂可以减少植物寄生线虫的侵害，木霉培养滤液对黑僵菌的拮抗作用证明了这些微生物的生物防治效果。

总结

富木霉的印楝饼在盆栽和田间环境下的优异表现，是当前线虫学研究中的一线曙光。

在本次实验中我们发现，木霉抑制根结线虫并增加植物的耐受性，木霉木霉的生物防治活性归因于植物抗毒素的积累。

由于根结线虫数量减少，富木霉的印楝饼处理的秋葵植株生长增加，与未经处理的植物相比，经过处理的植物根系从土壤中吸收了更多的养分。

目前的研究表明，富含木霉的印楝饼可以用来防治蔬菜作物的根结线虫，楝树及其衍生物大大减少了植物寄生线虫。

印楝树的所有区域都含有有毒化学物质，如印楝素和宁宾(次生代谢物)，它们具有防止线虫感染和抑制线虫增殖的保护作用。

富含T. asperellum FbMi6的印楝饼通过提高多酚、总叶绿素、氮平衡指数、花青素和黄酮类等生化和生理特性，提高了线虫感染植株的耐受性。

次生代谢物如酚类化合物的形成阻碍了线虫的繁殖，类黄酮抑制线虫运动和卵孵化，并在植物防御中发挥重要作用。

酚类化学物质是在植物对线虫胁迫的反应中产生的，植物中积累的酚含量决定了其抗逆性水平。

与未经接种的对照相比，使用生物制剂(铜绿假单胞菌)和印楝饼在棉花中产生了系统性抗性，氨和较高碳氮比的有机输入对植物寄生线虫具有杀线虫作用，这些物质也可能影响根结线虫卵的生存能力和孵化。

有机添加物改变了土壤的理化和物理性质，这对线虫的运动和宿主的发现有有害的影响，类似的技术可能对秋葵的根结线虫有效。

根据我们的研究结果，通过盆栽和田间研究表明，含有木霉FbMi6的印楝饼显著减少了不知名的印楝种群，实验证明，在室外环境下，富FbMi6的印楝饼对根结线虫具有显著的防治效果。

参考文献

[1]赵劲捷，《根瘤内生细菌抗南方根结线虫的生物活性研究》

[2]付艳艳,张洁,朱文倩等，《南方根结线虫生防菌YB-1503菌株鉴定及作用机理研究》

[3]陈晨,高永峰,王新荣等，《南方根结线虫MiPDCD6基因多克隆抗体的制备》

[4]邓小大,袁永强,蔡书静等，《基于RNA-seq的番茄响应根结线虫MiPDCD6蛋白的SA信号通路基因鉴定与表达分析》

[5]谢家廉，《南方根结线虫效应蛋白Misp12功能分析和淡紫紫孢菌寄生适应性的比较基因组研究》

[6]吴路平，《南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制寄主免疫的相关基因克隆及表达分析》

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