串叶松香草提取物抗氧化活性研究

互推小编 2023-06-04

摘要：

目的：测定串叶松香草水提液中抗氧化成分含量及活性。方法：选用串叶松香草干叶，通过单因素试验，分别从浸提pH、料液比、浸提温度、浸提时间及搅拌条件等方面确定最佳提取条件，测定串叶松香草水提液中抗氧化成分含量，并研究体外抗氧化活性。结果：串叶松香草提取物中主要含超氧化物歧化酶（SOD）、黄酮化合物、多酚化合物和维生素C，含量分别为232.91 U/g，7.9 mg/g，3.84 mg/g，1.26 mg/g。结论：串叶松香草水提液有较强的清除羟自由基·OH和DPPH·自由基的能力，且在一定范围内，清除效果随质量浓度的升高而加强。

串叶松香草（Silphium perfolialum L.），别名松香草，又名法国香槟草、菊花草，属菊科多年生草本植物，株高2.0~3.5 m，是原生长于美国的一种牧草，1979年由北京植物园从朝鲜引进，中国农业科学院试种成功，此后在全国的20多个省、市、区开始试种串叶松香草为多年生牧草，产量高、适应性强，是一种叶蛋白含量丰富、超氧化物歧化酶（SOD）活性含量高的草本植物。

《现代草药》[3]报道，串叶松香草的根可入药，用作强壮剂或补剂、具有抗疲劳、改善体质及利尿、发汗、补虚的作用，其粗蛋白含量接近或超过豆科植物，占干重的17.83 %~20 %，从串叶松香草中提取浓缩后的蛋白质含量高达80 %以上，其氨基酸组成合理，有人体必需的8种氨基酸。西北大学测得串叶松香草含有人体所需的全部必需氨基酸，其氨基酸组成优于联合国粮农组织的标准模式。尤其是限制性氨基酸赖氨酸和SOD的含量较高，

因此生物价值很高。目前，国内对串叶松香草的研究主要集中在其叶蛋白的开发和利用上，而其体外抗氧化活性的研究鲜有报道。本文旨在通过几个体外试验体系（羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基）研究串叶松香草水提取液的抗氧化活性，以期为串叶松香草在保健品、医药等行业中的应用提供一定的实验和理论参考。

1 材料与试剂

1.1 仪器

UV-5200型紫外可见分光光度计（上海元析）；AB104-N型电子分析天平（梅特勒-托利多）；JYL-6C型料理机（九阳）。

1.2 材料

串叶松香草干叶（北京南北乐草业），料理机粉碎后放入塑料袋中贮藏备用；芦丁（含量≥95.0 %，国药集团）；三羟甲基氨基甲烷（含量≥99.0%，国药集团）。连苯三酚、邻二氮菲、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、福林-酚试剂、抗坏血酸、硝酸铝、氢氧化钠、过氧化氢等，均为分析纯。

2 方法

2.1 含量测定方法

2.1.1 SOD活性测定将50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.20）与50 mmol/L连苯三酚溶液25 ℃保温20min以上，在石英比色皿中加入3 mL Tris-HCl缓冲液，放入分光光度计（λ=325 nm），以此溶液作为空白对照，然后在缓冲液中加入6 μL连苯三酚，测定3min内每1 min吸光度A值的变化ΔA连325/min。然后取3 mL Tris-HCl缓冲液加至石英比色皿，加入预热的

SOD酶液，摇匀，再加入6 μL连苯三酚，测定A值的变化（ΔA酶325/min），并作记录（控制连苯三酚自氧化速率ΔA连325/min约0.07，控制SOD抑制连苯三酚自氧化速率ΔA酶325/min约50 %）。

酶活性定义：25 ℃时，1 mL反应液中每1 min抑制连苯三酚自氧化速率达50 %时的酶量为一个活性单位。

2.1.2 总黄酮含量测定（1）标准曲线的绘制准确称取预经105℃干燥至恒重的芦丁标准品109.1 mg置入100 mL量瓶，加适量60 %乙醇，微热使溶解，待凉后加60 %乙醇稀释至刻度，摇匀。准确吸取此溶液10 mL置入50mL量瓶，加30 %乙醇稀释至刻度，摇匀，备用（1 mL含无水芦丁0.218 mg）。准确吸取上述母液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0mL分别置入25mL量瓶，用30 %乙醇补充至10 mL。精确加5 %亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min；然后加10 %硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min；再加1 mol/mL氢氧化钠溶液10 mL，用蒸馏水稀释至刻度，振摇，放置15min。以不加样品为参比，在510n m处测定A，可得标准曲线。

（2）总黄酮的测定准确吸取2 mL样品液置入25 mL量瓶，用30 %乙醇补至12 mL，加入5 %亚硝酸钠2.00 mL，摇匀，放置5 min后加入10 %硝酸铝2 mL，放置6 min后加入1 mol/L氢氧化钠10 mL，混匀，以30 %乙醇定容至刻度，放置10 min后，以相应溶剂做空白对照，在510 nm处测定A，计算总黄酮的含量。

2.1.3 总多酚含量测定（1）标准曲线的绘制。准确称取真空干燥至恒重的没食子酸标准品44.3 mg，用水溶解并定容至100 mL。以此溶液配成浓度为8.86 ，17.72 ，35.44 ，3.16 ，70.88，88.60 g/mL的溶液。分别取上述不同浓度溶液1 mL加至10 mL比色管中，然后依次加入1 mL去离子水，0.5 mL已稀释2倍的福林-酚试剂，1.5 mL 26.7% 碳酸钠溶液，用水定容至10mL，室温下反应2 h，在760 nm处测定A。由A对浓度进行回归，得标准曲线。

（2）总多酚的测定准确称取适量试样，用水溶解，浓度约0.08 mg/mL。取1 mL样品液加至10 mL比色管中，依次加入去离子水1mL、福林-酚试剂0.5mL、26.7 % 碳酸钠溶液1.5 mL，用水定容至10 mL，室温下反应2 h，在760 nm下测其A。

2.1.4 维生素C含量测定

（1）标准曲线的制作。准确称取抗坏血酸10 mg，加2 mL 10 %盐酸，加蒸馏水定容至100 mL，混匀，此抗坏血酸溶液的浓度为100μg/mL。取带塞刻度试管8支分别加入标准抗坏血酸0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL，均加蒸馏水至10 mL。以蒸馏水为空白，243 nm处测标准系列抗坏血酸溶液的消光值，以抗坏血酸含量（μg）为横坐标，以相应的消光值为纵坐标作标准曲线。

（2）样品的测定：样品液测定，量取0.2 mL提取液，放入盛有0.4 mL 10 %盐酸的10 mL量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在243nm处测定其消光值；待测碱处理样液的测定，分别吸取0.2 mL提取液、2 mL蒸馏水和0.8 mL 1mol/L氢氧化钠溶液依次放入10 mL容量瓶中，混匀，15 min后加入0.8 mL 10 %盐酸，混匀，并定容至刻度。以蒸馏水为空白，243 nm处测定其消光值。

2.2 抗氧化性研究

2.2.1 羟自由基（·OH）清除试验量取0.75 mol/L邻二氮菲溶于1 mL于试管中，依次加入磷酸缓冲液2 mL和蒸馏水1 mL，充分混匀后，加入0.75 mmol/L 硫酸亚铁溶液1 mL，立即混匀，加入0.01%过氧化氢溶液1 mL，轻轻混匀。37 ℃保温60 min，在536 nm处测A，其值称Ap。上述步骤以1 mL蒸馏水代替1 mL过氧化氢，测得A称AB。用1 mL试样液代替蒸馏水，测得的A称AS。按下式计算·OH清除率（d）：

2.2.2 DPPH·清除试验标准曲线制作：准确称取DPPH标准品25 mg，用甲醇定容至500 mL。得浓度为0.5 mg/mL母液，再用甲醇稀释成不同浓度，于517nm处分别测定A，制作标准曲线。样品测定：取一定黄酮浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）待测样品的甲醇溶液0.2 mL，加入7.8 mL浓度为0.025 mg/mL DPPH·甲醇溶液，立即混匀，于517nm处在一定时间间隔内测定At，直到读数稳定。

3 结果与分析

3.1 串叶松香草提取工艺的研究通过单因素试验，分别从浸提pH、料液比、浸提温度、浸提时间及搅拌条件的影响等方面研究串叶松香草水提取液的最佳提取条件。

3.1.1 料液比的影响准确称取一定量的串叶松香草干叶，以水为溶剂，分别以料液比1:6、1:7、1:7.5、1:8、1:9的比例浸提，经过25 h浸泡，用2.1.1的方法测定活性，见图1。

结果表明，串叶松香草水提液在1:7.5料液比下活性最高，因此最佳料液比为1:7.5。3.1.2 pH值的影响准确称取一定量的串叶松香草干叶，以水为溶剂，以氢氧化钠溶液分别调pH至6、6.5、7、7.5、8浸提，经过25 h浸泡后测定活性，见图2。

由图2可见，pH 7时，串叶松香草水提液的活性最高，提取效果最好。

3.1.3 温度及时间的影响准确称取一定量的串叶松香草干叶，以水为溶剂，以氢氧化钠溶液分别调pH至7，分别在水浴30 ℃和室温条件下浸提，并每隔2 h取样品液测定活性，见图3。由图3可见，串叶松香草水提液的活性随着时间延长呈先升后降的趋势，24 h时活性最高，由于12 h的活性与24 h相差不大，为节约时间成本，最佳提取时间设为12 h。另30℃水浴下的提取效果比室温条件要好，因此提取温度设为30 ℃。

综上所述，串叶松香草干叶在30 ℃水浴下，料液比1:7.5，调pH 7.0，搅拌提取12 h时，提取效果最好，此时SOD活性为232.91 U/g。通过此提取工艺得到的串叶松香草水提液利用2.1.2、2.1.3和2.1.4方法测定其中的抗氧化物质黄酮含量为黄酮化合物7.9 mg/g，多酚化合物3.84 mg/g，维生素C 1.26 mg/g。

3.2 抗氧化性试验结果

3.2.1 串叶松香草水提液对清除·OH的作用实验以抗坏血酸和芦丁标品作为对照见表1。由表1可见，在0.28～0.84 mg/mL浓度范围内，串叶松香草水提液有较强的清除·OH能力，且清除能力随浓度的增加而增大。浓度为0.84 mg/mL时，串叶松香草水提液对·OH的清除率分别是抗坏血酸和芦丁的1.3倍和1.0倍。

3.2.2 串叶松香草水提液清除DPPH·作用 DPPH·是一种稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则提示受试物具有降低·OH、烷自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH·有个单电子，在517 nm处有强吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，517nm处可以动态监测其对DPPH·的清除效果。