《先进材料》水凝胶可一年内实现长期软骨修复和对骨关节炎的保护

互推小编 2023-05-22

【科研摘要】

修复组织的质量下降和局灶性骨关节炎（OA）的潜在发展使局灶性关节软骨缺损的再生变得复杂。生物材料指导的基因治疗可通过以时空方式控制治疗序列的释放来增强软骨修复。最近，萨尔大学Magali Cucchiarini教授团队通过藻酸盐水凝胶（IGF-I/AlgPH155）传递编码人胰岛素样生长因子I（IGF-I）的重组腺相关病毒（rAAV）载体的优势可增强软骨全层修复报告了小型猪与对照（lacZ/AlgPH155）治疗一年后微骨折手术后的缺陷。与使用lacZ/AlgPH155治疗一年的缺损相比，在使用IGF-I / AlgPH155处理的缺损修复组织中以及在缺损周围的软骨中，均可实现持续的IGF-I过表达。

相对于lacZ/AlgPH155（半定量总组织学评分，细胞密度，基质沉积），IGF-I/AlgPH155的给药在一年内显着改善了软骨修复的参数，而没有有害或免疫反应。值得注意的是，与lacZ/AlgPH155治疗相比，一年后IGF-I/AlgPH155的递送还可以显着减少局灶性OA和炎症。生物材料指导的rAAV基因转移代表了一种有价值的临床方法，可促进软骨修复和预防OA。

相关论文以题为Hydrogel‐Guided, rAAV‐Mediated IGF‐I Overexpression Enables Long‐Term Cartilage Repair and Protection against Perifocal Osteoarthritis in a Large‐Animal Full‐Thickness Chondral Defect Model at One Year In Vivo发表在《Advanced Materials》上。

【图文解析】

2.1通过rAAV /藻酸盐介导的基因转移以及体外小型猪的软骨缺损有效地表达IGF-I

候选rAAV-hIGF-I/藻酸盐水凝胶系统（IGF-I/AlgPH155）首先在最合适的载体剂量下进行了测试，以确定其在体外促进MSCs再生IGF-I表达的能力，MSC 软骨缺损，作为该方法相对于控制条件的功能概念的证明，包括rAAV-lacZ/藻酸盐水凝胶系统（lacZ/AlgPH155），无载体的水凝胶系统（AlgPH155），无水凝胶的载体（ IGF-I/-或lacZ/-处理），而水凝胶和rAAV均不存在（-/-处理）。相对于所有其他条件，包括无水凝胶的rAAV-hIGF-I（IGF-I/-治疗），在分析的任何时间点，IGF-I/AlgPH155的施用均导致IGF-I表达水平显着升高（从第一天到第二十一天，是评估的最长时间点（相差最多4.7倍）（图1）。

图1 在使用rAAV/AlgPH155水凝胶系统处理的MSC中检测转基因（IGF-1）表达。如实验部分所述，将IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统直接用于MSC的培养长达21天。对照包括不使用rAAV的水凝胶的应用（AlgPH155），以相似的载体剂量施用无水凝胶的rAAV载体（IGF‐I/‐或lacZ/‐处理），以及既不使用水凝胶也不使用rAAV（‐/‐处理）。如实验部分所述，通过ELISA在指定的时间点测量IGF-I的累计表达。相对于lacZ / AlgPH155（a），AlgPH155（b），IGF-I /-（c），lacZ /-（d）和-/-（e）处理具有统计学意义。

图2 检测经rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损的修复组织中的转基因（IGF-1）表达。将IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统（每个缺损25 µL；3.6×105转基因拷贝）植入在股骨外侧，远端股骨滑车产生的软骨缺损（直径4 mm，深度5 mm）中植入一年。实验部分所述的标准化微骨折后的小型猪。含有缺陷的骨软骨单位在一年后被回收，并按照实验部分所述通过免疫组织化学处理以监测IGF-I的表达（插图：缺陷周围软骨中IGF-I的检测；放大倍数×10；所有代表性数据）。

2.2通过rAAV/藻酸盐介导的基因转移导致的IGF-I过表达对小型猪软骨缺损修复过程的影响

体内治疗一年后，IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155治疗在半定量评分系统的单个或全部类别中均无显着差异，该评分系统对此类缺陷的宏观修复进行了分级（图3），没有任何迹象任一治疗组在这个时间点的骨赘形成，宏观滑膜炎或免疫细胞浸润（CD3，CD11b和HLA-DRα表达缺失）的变化（未显示）。

图3 对经rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损的修复组织进行宏观分析。如图2和实验部分所示，将IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统植入小型猪软骨缺损中。一年后取回含有缺损的骨软骨单位，以进行宏观评估，如实验部分所述（所有代表性数据）。

对经rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损的修复组织进行宏观分析。IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统植入了小型猪软骨缺损中，如图2所示。使用半定量评分对免疫染色切片上的II型胶原强度进行评估后发现，一年后接受IGF-I / AlgPH155的缺损修复组织中该主要ECM成分的沉积明显强于lacZ/AlgPH155（1.3倍）差）（图5A）。取而代之的是，此时IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155缺陷之间的I型胶原沉积没有差异（图5B）

图4 rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损中修复组织的组织学分析。将IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统植入小猪软骨缺损中，如图2和3以及实验部分所示。如实验部分所述，含有缺陷的骨软骨单元在一年后被回收并进行了番红蛋白O/H＆E染色处理。（*）表示整合地点，（A）中的方框表示（B–D）中描述的区域。

图5 免疫组化分析了经rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损的修复组织中ECM成分的表达。IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统被植入到小猪软骨缺损中，如图2-4和图4以及实验部分所示。A，B）含有缺陷的骨软骨单位在一年后被回收并进行处理，以通过免疫组织化学方法评估II型胶原（A）和I型胶原（B）的沉积，如实验部分所述（放大倍数×4）。

2.3随着时间的流逝，通过rAAV /藻酸盐介导的基因转移对IGF-I的过度表达对小猪软骨缺损的炎性反应和孔旁OA的影响

使用已建立的逆OA评分分析与缺损相邻的软骨中的OA特征，发现一年后与lacZ / AlgPH155相比，用IGF-I / AlgPH155处理的缺损周围的总局灶性OA显着降低（相差1.2倍），在这个时间点，具有改善相邻软骨结构，细胞克隆，区域染色和潮汐/软骨下骨的个体参数的趋势（相差最大1.6倍）（图6）。

图6 rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损附近软骨的组织学分析。IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统植入在小猪软骨缺损中，如图2-5-2-5和实验部分所示。如实验部分所述，含有缺陷的骨软骨单元在一年后被回收并进行番红O染色。（*）表示积分位置，（A）中的方框表示（B–D）中所示的区域（A：放大倍数×4；B：放大倍数×10；C：放大倍数×20；D：放大倍数×40；所有具有代表性的数据）。

图7 免疫组织化学分析了经rAAV/AlgPH155处理的小型猪软骨缺损的修复组织和周围软骨中的炎症反应。如图2-6-6-6和实验部分所示，IGF-I/AlgPH155和lacZ/AlgPH155水凝胶系统植入了小型猪软骨缺损中。A，B）一年后取回含有缺损的骨软骨单位，并进行处理以通过免疫组织化学评估缺损修复组织和周围软骨中IL-1β（A）和TNF-α（B）的表达（插图）（如实验部分所述）（放大倍数40；所有代表性数据）。

【总结】

该研究首次首次证明水凝胶（藻酸盐）指导的治疗性rAAV基因传递的潜在益处，可改善体内软骨修复，同时有利于在较长时期内减少局灶性OA和炎症时间与对照治疗的比较。该研究的局限性在于缺乏定量的生化分析以及对修复的软骨和邻近组织的机械功能的评估。由于在此处测试的条件下未实现完全再生，因此可能需要同时使用其他候选药物，例如软骨修复和抗肥厚性软骨特异性性别决定区域型高迁移率族框9（SOX9）转录因子。由于可以成功地建立这些载体的共转导而没有病毒干扰，因此可以通过藻酸盐同时或独立地通过多种rAAV进行基因转移来进行。综上所述，目前的发现突出了rAAV/AlgPH155水凝胶系统的价值，因为未来的直接，微创，现成的解决方案，可用于增强外科手术疗法，以在临床情况下修复软骨缺损。从未来的临床角度来看，考虑到长期软骨修复的增强和对局灶性OA的保护，对称性模式将在关节镜刺激下理想地在水凝胶引导下，rAAV介导的治疗基因序列的过表达。

参考文献：doi.org/10.1002/adma.202008451

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