J.Agric.Food Chem.│理性设计其柔性区域提高茂原链霉菌转谷氨酰胺酶的热稳定性和催化活性

互推小编 2023-05-05

今天推送的文章发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上的“Enhanced Thermostability and Catalytic Activity of Streptomyces mobaraenesis Transglutaminase by Rationally Engineering Its Flexible Regions”，作者为江南大学的刘松副教授。

转谷氨酰胺酶(TGase,EC 2.3.2.13)催化Gln残基与蛋白质中不同酰基受体之间形成ε-(γ-谷氨酰)异肽键，从而导致交联或小分子修饰。TGase广泛应用于肉类、酸奶、奶酪、面包加工等食品加工行业。近年来，TGase的应用迅速扩展到制药、纺织、皮革等非食品领域。1989年，首次从Streptomyces mobaraenesis (smTG)中分离出TGase。与其他微生物TGase相比，smTG具有更高的活性和更广泛的底物范围，已成为商业TGase的主要来源。然而，野生型smTG在60 °C(t_1/2(60 °C))下的半衰期仅为2分钟，不利于高温下的应用。因此，需要产生具有高热稳定性的smTG突变体。

为了提高热稳定性，定向进化（随机突变）、半理性设计（“热点”处的饱和突变、DNA改组）和理性设计（二硫键的构建）方法已被用于修饰smTG。其中，饱和突变和DNA改组产生了比活性和热稳定性显着增强的突变体（S23V-Y24N-K294L）。随后，将正突变S2P和S199A引入S23V-Y24N-K294L，产生突变体S2P-S23V-Y24N−S199A-K294L（TGm1），其t_1/2（60 ℃）和比活性分别比smTG高12.4倍和114.2%。作者在TGm1的基础上，通过脯氨酸扫描和底物结合口袋修饰生成了FRAPD-TGm2，其t_1/2(60 °C)比TGm1高3倍。通过合理地将带负电的残基引入FRAPD-TGm2，获得了酶学性质进一步改善的FRAPD-TGm2-N96E-S144E-N163D-R183E-R208E-K325E(FRAPD-TGm3)突变体。FRAPD-TGm3的比活性和t_1/2(60 °C)分别达到83.74 U/mg和122.91 min，为迄今报道的最高水平。尽管对底物CBZ-Gln-Gly具有更高的比活性，但当用于酪蛋白交联时，FRAPD-TGm3的效率远低于FRAPD-TGm2。引入的表面静电荷有可能增强了FRAPDTGm3和酪蛋白之间的电排斥力，从而降低了它对后者的亲和力。因此，有必要开发一种新的策略来进一步提高FRAPD-TGm2的热稳定性。

一般认为，柔性区是导致酶稳定性差的关键区域之一。基于折叠自由能变化的柔性区修饰有望成为提高TGase等工业酶热稳定性的新途径。在本研究中，作者试图通过在不降低酪蛋白交联效率的情况下合理修饰其柔性区域来提高FRAPD-TGm2的热稳定性。首先，对FRAPD-TGm2进行了分子动力学模拟以确定其柔性区域。然后，开发了基于Rosetta Cartesian_ddg的脚本以获得折叠自由能显着降低的FRAPD-TGm2突变体，从中鉴定出热稳定性提高的突变体。第三，评估了突变体对β-酪蛋白的交联效率。最后，基于分子动力学模拟分析了增强稳定性和比活性的机理。具有良好的酪蛋白交联效率，此处获得的高度稳定的TGase突变体可能有利于改变蛋白质食品的质地。此外，该修饰策略还可用于识别其他酶的热稳定突变体，工作量和计算资源很少。

基于MD鉴定FRAPD-TGm2中的HFRs

为了改善大肠杆菌中的TGase表达，作者之前在smTG的N末端融合了TrxA和Streptomyces hygroscopicus TGase前区。在体外用分散酶激活后，与天然smTG相比，重组smTG的N端多了一个五肽(FRAPD)。在本研究中，作者在TGm2的N末端融合了TrxA和S.caniferus TGase前区，在体外激活后产生具有相同五肽(FRAPD-TGm2)的活性酶。为了识别高温下的高柔性区域(HFR)，构建了FRAPD-TGm2的模型结构，并分别在330和360 K下进行了MD分析。根据RMSF值，确定了五个高度柔性的区域，包括HFR I（残基1-25）、HFR II（残基235-265）、HFR III（残基89-122）、HFR IV（残基163-195）、和HFR V（残基210−226）（图1）。值得注意的是，HFR I和HFR V位于底物结合口袋中（图1B）。为了避免对底物结合的影响，选择了其余三个区域（HFR II、HFR III和HFR IV）进行修饰。

通过降低折叠能提高FRAPD-TGm2的热稳定性

基于Rosetta Cartesian_ddg，作者开发了两个脚本，分别用于特定酶区域内的虚拟饱和突变和折叠自由能变化计算。然后，这些脚本用于分析FRAPD-TGm2的HFR III、HFR IV和HFR V。筛选了具有最低折叠自由能的前18个突变体（图2A）。在选定的突变体中，有16个突变体被成功表达和纯化。为了表征热稳定性，纯化的突变体在60 °C下进行热处理20分钟。图2B显示，与FRAPD-TGm2相比，S116A和S179L的残余活性分别增加了6.2%和6.3%。E164L、R183P和S84F的残留活性没有显着变化，而其余突变体显示残留活性降低（图2B）。需要注意的是，S116A、S179L、S116C和E164V的比活性比FRAPD-TGm2增加了5%以上（图2B）。

进一步增强FRAPD-TGm2热稳定性的组合突变

为了进一步提高热稳定性，将两个正突变（S116A和S179L）同时引入FRAPD-TGm2，产生突变体FRAPD-TGm2-S116A-S179L(FRAPD-TGm2A)。同样，纯化的FRAPD-TGm2A在60 °C下进行热处理。与FRAPD-TGm2相比，FRAPD-TGm2A在20分钟时的残留活性增加了8.8%，并且随着孵育时间的延长，这种残留活性差异进一步增大（图3A）。结果，与FRAPD-TGm2相比，FRAPD-TGm2A的t_1/2(60 °C)增加了0.8倍，T_m增加了0.6 °C（表1）。测定了FRAPD-TGm2A在不同温度下的比活性和对CBZ-Gln-Gly的动力学参数，以了解催化性能的影响。如图3B所示，FRAPD-TGm2A在每个温度下都表现出比FRAPD-TGm2更高的比活性，并且两种酶具有相同的最佳温度（60 °C）。因此，与FRAPD-TGm2相比，FRAPD-TGm2A具有更大的k_cat/K_m值，尽管其K_m略有下降。

使用FRAPD-TGm2及其突变体交联β-酪蛋白

纯化后，smTG及其突变体在相同TGase活性单元存在的情况下测试了β-酪蛋白（UniProt：P02666）的交联效率。通过SDS-PAGE分析分析催化反应过程。在FRAPD-TGm2、FRAPD-TGm2A和smTG的情况下，β-酪蛋白带(28 kDa)在5分钟时变得更薄，并在40分钟时完全消失（图4A）。在此过程中，凝胶顶部出现大量蛋白质条带（图4A），表明高分子量蛋白质的积累。然而，当用FRAPD-TGm3处理时，β-酪蛋白和高分子量蛋白条带在反应5分钟后发生显着变化，β-酪蛋白条带保持清晰直到40分钟（图4A）。对于每个反应，在5分钟时采集的样品用8M尿素处理并进行SEC分析。如图4B所示，每个SEC曲线中存在两个峰，Peak1（在160-200 mL处洗脱）和Peak2（在110-160洗脱）。对照样品（无TGase反应的β-酪蛋白）具有尖锐的Peak1和平坦的Peak2。对于具有TGase反应的样品，Peak1面积随着Peak2面积的增加而减少。需要注意的是，FRAPD-TGm2、FRAPD-TGm2A和smTG共享一个相似的Peak2，比FRAPD-TGm3大得多。根据蛋白质标准品的峰，Peak1和Peak2分别对应于β-酪蛋白及其交联产物（图4B）。基于smTG的Peak2面积，计算每个TGase突变体的相对交联效率。FRAPD-TGm2A与FRAPD-TGm2具有相似的β-酪蛋白交联活性，显着高于FRAPD-TGm3。值得注意的是，当使用相同的TGase单位时，FRAPD-TGm2A的交联活性略低于smTG。

了解增强热稳定性和催化活性的机制

为了了解稳定机制，FRAPD-TGm2和FRAPD-TGm2A的MD模拟在330 K下进行了50 ns。结果表明，FRAPD-TGm2A的平均和最终RMSD值（平均值：0.248；最终：0.257）低于FRAPD-TGm2（平均：0.255；最终：0.306）（图5）。与FRAPD-TGm2相比，FRAPD-TGm2A在Leu179的侧翼区域（残基182-187）显示RMSF显着减少，在Ala116（残基96-102）附近的RMSF显着增加（图5）。需要注意的是，在位于底物结合口袋中的HFR IV（残基210-213）、HFR V（残基246-251）和N末端残基(FRAPD)区域内也观察到RMSF增加。在50 ns模拟期间，与FRAPD-TGm2（平均：268.79）相比，在FRAPD-TGm2A中检测到更多氢键（平均：275.86）。

为了解FRAPD-TGm2A增强的比活性，酶-底物复合物的MD模拟在330 K下进行50 ns。使用DS柔性对接工具，CBZ-Gln-Gly与FRAPD-TGm2和FRAPD-TGm2A对接，分别生成42和61个对接姿势。通常，TGase反应开始于酶内Cys64的巯基对谷氨酰胺侧链（酰基供体）的羰基碳的亲核攻击。因此，选择了Cys64的硫醇基团与CBZ-Gln-Gly的酰基胺之间的距离小于4 Å的对接姿势，包括FRAPD-TGm2中的Pose7\Pose21和FRAPD-TGm2A中的Pose11\Pose18\Pose23。最终选择CDOCK能量最低的Pose7(FRAPD-TGm2)和Pose11(FRAPD-TGm2A)进行MD分析(330 K, 50 ns)。在MD分析期间，FRAPD-TGm2A的RMSD值主要小于FRAPD-TGm2，而CBZ-Gln-Gly的RMSD值在两种酶中相似（图5B）。此外，在Leu179（residues183−185）附近的区域检测到RMSF减少，但底物口袋几乎没有变化（图5B）。在MD模拟期间，FRAPD-TGm2A和CBZ-Gln-Gly之间的平均氢键数（平均数：3.86）高于FRAPD-TGm2和底物之间的氢键数（平均数：3.0）。

复合物的聚类分析是根据MD模拟过程中的RMSD变化进行的，并使用从Top1聚类的平均值导出的结构进行相互作用分析。结果显示，与FRAPD-TGm2相比，FRAPD-TGm2A的总氢键数量、疏水相互作用和静电相互作用分别增加了7、1和2（表2）。如图6所示，FRAPD-TGm2中的Ser116和Ser179分别形成了四个和三个氢键。在FRAPD-TGm2A中，Ala116形成两个氢键和一个新的疏水相互作用(Phe85)，而Leu179形成一个氢键和一个新的疏水相互作用(Pro316)。