客户文章 | 代谢流-肿瘤细胞的支链氨基酸代谢重组与耐药

互推小编 2023-05-15

『支链氨基酸代谢重编程协调了对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药性』

● 期刊：Cell Rep

● IF=8.1

● 发表时间：2019-07

导读

耐药性是癌症有效治疗的重要障碍。虽然表皮生长因子受体（EGFR）突变癌细胞对致死性EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的耐药机制已被深入研究，但癌细胞在亚致死性药物治疗下如何协调适应性反应仍然是个未知数。在这里，我们发现2-h亚致死TKI治疗可在EGFR突变型肺癌细胞中引起短暂的药物耐受状态。持续的亚致死治疗强化了这种耐受性，甚至最终建立了长期的TKI抵抗力。这种适应性过程包括H3K9去甲基化介导的支链氨基酸转氨酶1（BCAT1）上调和随后的代谢重编程，通过减少活性氧（ROS）的积累促进TKI抵抗。TKI和ROS诱导试剂联合治疗克服了临床前小鼠模型的这种耐药性。临床资料分析支持BCAT1表达与EGFR-TKI反应的相关性。我们的发现揭示了BCAT1参与的代谢重编程在肺癌TKI抵抗中的重要性。

实验思路

实验结果

1.亚致死量TKI治疗引起癌细胞短暂和长期耐药

为了确定合适的亚致死剂量的EGFR TKI，我们用不同的药物浓度处理EGFR突变型肺癌细胞株PC9，发现10nM吉非替尼（GEF）治疗有效地阻断了EGFR的激活，而没有诱导明显的细胞凋亡，而药物浓度>100nm会触发明显的细胞凋亡（图1A、1B）。因此，我们使用这种亚致死剂量进行进一步的研究。我们进行了短期亚致死量治疗实验；将癌细胞暴露于亚致死量TKIs 2小时，然后在不同时间间隔在无药培养基中恢复，然后再暴露于更高剂量的TKIs 0.5小时。然后在MTT试验之前，将细胞在无药培养基中再培养72小时（图1C）。值得注意的是，亚致死量的GEF预处理使PC9细胞对随后更高剂量的GEF治疗更具耐受性（图1D）。连续3个月以上的亚致死量的GEF处理使实验细胞株对GEF产生了强烈的抗性。此后，我们将这些亚致死性TKI适应细胞称为STACs。STAC-P和STAC-H分别来自PC9和HCC827细胞。

图 1

2.H3K9甲基化降低与STACs的TKI抵抗有关

接下来，我们试图研究STACs对EGFR-TKI耐药的潜在机制。针对TKI抗性提出了几种机制（Rotow和Bi-vona，2017）。然而，使用扩增参照突变系统（ARMS）在STACs中未检测到EGFR T790M和KRAS突变。先前的研究揭示了组蛋白H3甲基化失调在TKI抵抗中的重要性（Guler等人，2017年；Sharma等人，2010年）。

因此，我们评估了这些TKI耐药细胞的一系列组蛋白H3甲基化模式。在检测到的H3甲基化中，STAC中H3K9me2和H3K9me3水平下降最显著（图2A）。H3K9me2和H3K9me3水平的可比性降低表明甲基化可能发生在H3K9me1到H3K9me2的步骤中。组蛋白甲基化是由甲基转移酶和去甲基化酶动态控制的。我们发现，在STAC中H3K9甲基转移酶的活性降低，而不是去甲基酶活性降低（图2B）。敲除两种已知的H3K9甲基转移酶（Shinkai和Tachibana，2011；Wang等人，2012年）中的任一种可使PC9细胞对GEF产生抗性，而对细胞增殖无显著影响（图2C、2D）。

类似地，用BIX01294（H3K9甲基反式ferase抑制剂）处理PC9或HCC827细胞（Janzen等人，2010年）促进了耐药性（图2E）。相反，G9a或SUV39H1单独异位表达部分恢复了STACs中的GEF敏感性（图2F、2G）。由于DNA去甲基化也可以通过TET蛋白调节（Wu和Zhang，2017），我们通过评估5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的水平来评估TET的酶活性。PC9与STAC-P和HCC827与STAC-H之间的5mC水平没有变化。与相应的对照相比，STAC-P和STAC-H中的5hmC水平降低，表明这些耐药细胞中的TET活性降低。然而，shRNA敲除TET1、TET2或TET3对亲本细胞系或其STAC衍生物的GEF敏感性无重大影响，表明TET可能不参与介导TKI抗性。因此，这些数据揭示了STAC-TKI抗性涉及H3K9去甲基化。

图 2

3.表观遗传上调的BCAT1有助于STACs对TKI的抵抗

我们探讨了哪些表观遗传调控的分子事件可能参与介导STAC-TKI抗性。对微阵列和RNA测序（RNA-seq）数据的综合分析显示22个基因在STACs中持续上调（图3A和S4A）。对这些基因的个体敲除确定了BCAT1是逆转STACs中TKI抗性的关键（图3B、S4B和S4C）。在STACs的建立过程中，BCAT1的表达增加，H3K9me2的水平逐渐降低（图S4G），表明H3K9甲基化对BCAT1表达的负调控作用。

接下来，研究者进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析，发现与对照组相比，STAC中BCAT1启动子区的H3K9me2和H3K9me3水平均降低（图3E和S4H）。此外，通过芯片证实，与对照细胞相比，STAC中G9a和SUV39H1与BCAT1启动子区域的结合也减少（图3F和S4I）。此外，对PC9细胞中H3K9me2和H3K9me3的芯片分析证实，敲除G9a或SUV39H1导致BCAT1启动子处的H3K9me2/3标记降低（图3G和3H）。同时，敲除PC9细胞中的G9a或SUV39H1上调BCAT1表达；相反，STAC-P中任一酶的异位表达则相反（图3I和3J）。这些数据表明在STACs中BCAT1的上调可能是通过表观遗传去抑制介导的，包括其启动子上的H3K9去甲基化。

图 3

4.BCAT1通过ROS清除协调STAC-TKI抵抗

为了确定介导BCAT1对STAC耐药的影响的下游机制，我们使用基因表达谱分析发现，BCAT1敲除细胞中氧化磷酸化和谷胱甘肽（GSH）代谢相关的通路明显失调。GEF治疗可促进EGFR突变癌细胞中ROS的积累（Okon等人，2015），而在GEF暴露的STAC中未观察到明显的ROS累积。

BCAT1表达通过产生抑制氧化应激的中间产物与ROS水平相关（Zhang和Han，2017）。BCAT1参与支链氨基酸的代谢主要涉及两条不同的途径，其末端产物不同：一条是通过GSH合成的限速酶——谷胱甘肽-半胱氨酸连接酶催化亚单位（GCLC）生成GSH以清除活性氧；另一条是通过支链酮酸脱氢酶复合物（BCKDK）产生辅酶A化合物参与三羧酸（TCA）循环（图4A；Lu，2013）。如预期，敲除GCLC，而不是BCKDK或支链酮酸脱氢酶E1（BCKDHA），降低了细胞内GSH，同时增加了STACs中的ROS水平。尽管STAC和对照组之间这些酶的蛋白质水平没有大的变化，但是敲除 GCLC下降明显使STACs对GEF敏感，而shRNA耐药GCLC的异位表达逆转了GEF治疗的shGCLC表型（图4B）。更重要的是，GCLC的异位表达完全阻断了shBCAT1对GEF抗性的影响（图4C），这表明GCLC需要介导BCAT1的作用。

由于GCLC参与GSH的生物合成，GSH是防止ROS引起的氧化损伤的重要抗氧化剂，因此我们确定了GSH在BCAT1介导的TKI抵抗中的作用。STACs细胞显示出高于其亲代细胞的GSH水平（图4D）。此外，在PC9和HCC827细胞中，BCAT1的异位表达增加了细胞内GSH的含量（图4E），而在STACs中敲除BCAT1显著降低了细胞内GSH含量（图4F）。此外，shRNA抗性BCAT1或GCLC的异位表达恢复了BCAT1缺失的STAC中的GSH水平（图4F）。同位素示踪实验进一步证实了BCAT1表达对GSH合成的贡献。BIX01294处理增加了PC9和HCC827细胞中的GSH含量（图4G），并且在STACs中SUV39H1的异位表达降低了细胞内GSH的含量（图4H）。由于谷胱甘肽与谷胱甘肽二硫醚（GSSG）的比值更能反映细胞的氧化还原状态，因此我们也测量了细胞的氧化还原状态GSH:GSSG比率在所有这些条件下，得到了相似的结果。此外，使用ROS清除剂（包括N-乙酰半胱氨酸（NAC）、酯化GSH或作为GSH补充剂的L-谷氨酰胺）的处理使PC9细胞对GEF治疗更具抵抗力（图4I、4J）。更重要的是，GCLC的异位表达和NAC的补充挽救了GEF治疗后STAC-P异种移植物中的shBCAT1表型（图4K），表明BCAT1基因敲除肿瘤对GEF的敏感性是ROS依赖的。这些发现支持这样一个观点：BCAT1通过GSH合成引起ROS积累，从而促进了STAC-TKI的抵抗。

图 4

5.GEF联合ROS诱导剂克服STAC-TKI抗性

研究者将GEF与ROS诱导剂联合治疗STACs。众所周知，小分子抑制剂，包括胡椒酮（PL）和异硫氰酸苯乙酯（PEITC）可通过促进ROS积累发挥抗肿瘤活性（Liu et al.，2014；Xiao et al.，2010）。GEF与PL或PEITC的组合有效地克服了体外STAC-P TKI耐药性（图5A、5B）。只有GEF和PL联合治疗显著抑制了STAC-P异种移植物的生长和细胞增殖，且ROS积累过多（图5C-5F）。在STAC-H细胞中观察到类似的结果。

此外，研究者从一名有EGFR L858R突变但显示EGFR-TKI耐药的患者身上建立了一种患者来源的异种移植（PDX；PDX-resistant，PDX-R）。与对GEF治疗敏感的PDX-S（PDX敏感）肿瘤相比，PDX-R肿瘤表现出更高的BCAT1表达（图5G）。同样，只有PL和GEF联合治疗才能有效地抑制PDX-R肿瘤生长，抑制细胞增殖，促进ROS积累（图5H-5J）。为了进一步验证我们的发现，我们在药理学上使用了一种更为特异的抑制剂——丁硫醚亚砜亚胺（BSO）来抑制GSH的合成，这种抑制剂在体内已被广泛应用，没有观察到毒性，并且具有更具体的作用机制。BSO治疗使STACs和PDX-R在体外和体内对GEF敏感，其影响可通过补充NAC消除（图4K、5K、5L）。与这些发现一致，ROS诱导剂auranofin（硫氧还蛋白还原酶1的成熟抑制剂）也能使STAC-P对GEF敏感，而NAC的补充明显阻断了其作用。这些数据表明，将TKI与ROS诱导剂联合使用可能是克服TKI抗性的有效方法。

图 5

6.BCAT1表达与EGFR-TKI治疗反应的临床相关性研究

为了评估BCAT1表达与EGFR TKI治疗反应之间的关系，我们检查了119例TKI敏感EGFR突变的肺癌标本，包括TKI治疗前的80个活检样本（基线）和39个TKI治疗复发样本。免疫组化分析显示BCAT1与H3K9me2或8-OXO水平呈负相关（图6A-6C）。复发组的BCAT1表达高于基线组（图6D），而BCAT1基因拷贝数没有明显差异（图6E）。在基线组，BCAT1高表达与TKI治疗无效的治疗反应相关（图6F）。与低BCAT1肿瘤患者相比，基线组高BCAT1肿瘤患者的无进展生存期更短（图6G）。而复发组中没有已知基因改变（如T790M突变、MET或HER2扩增）的患者往往具有较高的BCAT1表达（图6H）。这些结果支持BCAT1表达与EGFR突变肺癌患者TKI反应的相关性。