「综述学习」间充质干细胞治疗神经系统疾病（四）

互推小编 2023-06-09

原文文献：Mesenchymal Stem Cells for Neurological Disorders

Anna Andrzejewska, Sylwia Dabrowska, Barbara Lukomska, and Miroslaw Janowski

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8024997/

3.骨髓间充质干细胞在神经系统疾病治疗中的协同和补充作用

骨髓间充质干细胞仍处于相对早期的临床转化阶段。临床前文献丰富，而临床试验很少，也没有基于MSC的神经系统疾病产品注册。因此，将骨髓间充质干细胞与其他疗法相结合的研究相对较少，如果是这样，则最好将其与物理干预相联系，而不是药物干预。然而，最近，Elbaz及其同事指出，乐卡地平（LER）在中风模型中具有神经保护作用，在MSC移植前注射到HD动物模型中，并增强MSC抑制神经损伤的作用。LER/MSCs联合治疗优于MSCs单独治疗，改善HD移植物受者的运动和行为异常。因此，维生素C增强了MSCs对脊髓损伤的治疗效果。中药淫羊藿苷和间充质干细胞通过磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）途径协同促进脑缺血后血管生成和神经发生。

有趣的是，在AD大鼠模型中报道了跑步机运动和移植MSC的协同效应。这些研究表明，体力活动和MSC输注增加了MSC治疗对AD大鼠记忆障碍的影响。平板运动通过抗凋亡作用增强了脑缺血大鼠移植的骨髓间充质干细胞的治疗效力。在大鼠中风后，还观察到康复和静脉输注间充质干细胞的协同作用。在缺氧缺血性损伤后，将动物暴露在丰富的环境中可增强血管生成。也有报道称亚低温和脂肪来源的MSC对缺血性脑损伤具有协同作用。MSC移植和重复经颅磁刺激在促进血管性痴呆自噬和突触可塑性方面也有协同作用。骨髓间充质干细胞也与电刺激协同治疗帕金森病。总之，骨髓间充质干细胞可以与其他治疗策略协同作用，这种整体方法非常有吸引力，尽管成本可能是限制因素。

4.用于治疗中枢神经系统损伤和后续MSC迁移途径的移植方法

移植干细胞的给药方法对其在体内的位置、在给定组织内的生物分布以及在受影响区域的定植效率具有显著影响。在中枢神经系统结构受损的情况下，最常用的细胞给药途径包括局部和全身移植以及相对较新的鼻细胞移植技术（表3）。局部给药通常通过立体定向将细胞悬液注入脑脊液或直接注入损伤部位或其附近的脑实质来进行。这种方法允许大量的移植细胞在特定位置聚集；然而，对于播散性病变或覆盖器官重要区域的病变，不能确保移植细胞的正确分布。此外，由于氧气和营养物质在如此大的簇中的有效扩散受到限制，通过局部注射给药的细胞大量积累可能导致过早死亡。在移植过程中，必须将细胞给药装置（如套管）插入非常敏感的脑组织，对重要的大脑或脊髓中心造成出血或损害，导致患者功能紊乱。MSC脑内移植到健康大脑后，少量细胞从注射部位进一步迁移到脑实质。然而，在胼胝体移植中，观察到MSC沿着脑血管周围的白质束迁移。

鞘内移植是将细胞直接注射到脑脊液中。在人类，注射通常在蛛网膜和软脑膜之间的脊髓下部进行。鞘内给药的细胞可能随着脑脊液循环转移到大脑内的液体空间。在脊髓损伤模型中对鞘内移植的MSC进行的观察显示，MSC在损伤区域聚集，一些细胞穿透损伤组织的血管周围间隙。Kim等人发现鞘内注射的MSC在给药后12小时内扩散到大脑区域，而不存在于其他器官，包括心、肺、肝、脾和肾。据估计≈2.4%的移植细胞定位于大脑，因此相对较低。在动物体内，鞘内注射后，在移植后一周内通过生物发光技术检测骨髓间充质干细胞。在另一项研究中，在注射后24小时，在小鼠的脊髓和心脏以及四个月后动物的心脏和大脑中检测到了骨髓间充质干细胞的遗传物质。目前，在许多临床试验中都使用单次和多次鞘内注射MSC。有些病人抱怨背痛；然而，与鞘内细胞输送相关的最大问题是由细胞诱导的梗阻引起的异常脑脊液流动的风险，这可能导致脑积水。

系统性移植通常通过静脉注射细胞来完成，其特点是手术侵袭程度最低。在静脉注射的情况下，移植细胞通常在注射几天后少量出现在大脑受损区域。相比之下，动脉途径似乎是脑内和全身给药优势的有吸引力的组合。动脉内给药使细胞几乎立即到达病变区域，通常呈小簇状散布于病变区域的整个空间；此外，它在不破坏中枢神经系统结构连续性的情况下进行，中枢神经系统结构对所有操作都极为敏感。因此，与静脉注射相比，动脉内注射可导致更多具有更均匀和更广泛分布区域的移植细胞更快地定植病变。与细胞群命运中细胞的跨血管移植相关的一个基本问题是没有占据受损区域。根据文献，高达90%的静脉注射细胞积聚在肺血管中。这可能导致肺栓塞，这是致命的，在动物和人类中都有报道。在一些研究中，作者通过使用抗凝剂的形式来解决这个问题，比如肝素，这似乎是解决这个问题的好方法。然而，我们应该假设其使用将影响移植的MSC自身的粘附能力，并可能影响损伤区域的定植程度。在肾脏、脾脏和肝脏等其他器官中也检测到静脉注射细胞。在动脉内注射细胞时，它们在肺部的沉积要小得多，注射后，大多数细胞都出现在大脑受损区域。动脉内输送至健康大脑的MSC存在于运动和感觉皮质、海马、纹状体、丘脑和下丘脑，在脑血管内或移植后至少三天内观察到这些细胞。从脑损伤到移植的时间对于动脉内输送细胞的中枢神经系统定植程度很重要。

当细胞在损伤后48-72小时内移植时，效果最好。在早期（损伤后24小时）和晚期（7天）时间点给予MSC可导致其在病变内的分布可忽略不计。动脉内注射细胞的分布和扩散高度依赖于脑血管系统的血流动力学状态。在中风的情况下，脑损伤后第二天似乎是细胞移植最有效的一天，因为损伤区域的水肿较低，血管部分再通可引导细胞流入，因此细胞移植的归巢率相对较高。然而，移植后数小时，许多细胞移向周围器官，主要是肝脏、肾脏和脾脏。由于注射细胞关闭了脑内小直径血管的管腔，动脉内移植可能与微栓塞的风险有关。在动物模型的输液过程中，这种情况与脑血流量的减少同时被观察到。给药后的病变数量、细胞剂量及其给药速度之间也存在相关性。然而，我们的研究结果表明，通过精确调整输注速率和相对大小的细胞数量，可以避免动脉内注射产生不必要的副作用。

鼻腔给药最初是作为一种向中枢神经系统结构输送药物的策略而开发的。当给药进入鼻腔的药物被支持细胞、双极嗅觉神经元和上颌支三叉神经吸收时，它们通过细胞内运输（如胞饮、内吞或扩散）发生渗透，从而进一步将它们输送到嗅球和其他脑区。药物也可能穿透细胞外途径，可能通过支持细胞之间的连接或通过支持细胞与嗅觉细胞之间的空间。以这种方式供应的物质可以穿透大脑或脑脊液。给药的细胞外途径提供了以分钟计算的更短的给药时间，而细胞内途径的给药过程则需要几个小时甚至几天，鼻腔给药的特点是比静脉注射更有效地将活性生物物质吸收到大脑中，这允许显著减少给药药物的剂量，同时保持相同的有效性水平。低分子亲脂性化合物的传递最有效。通过鼻腔途径给药细胞是困难的，主要是因为它们的体积大得多。尽管一些研究质疑通过鼻腔途径输送的细胞的有效性，但其他作者指出，在中枢神经系统疾病中移植MSC后，在嗅球、丘脑、下丘脑、纹状体、残端和皮质区域观察到它们。鼻腔给药5天后，在中脑、纹状体和嗅球中检测到一些MSC浓度最高；然而，7.5周后，它们不再可见。额外使用使鼻咽粘膜解封的物质，如透明质酸酶，会在使用1.5小时后增加给药细胞在大脑中可见的面积。然而，应用透明质酸酶与脑膜炎风险相关，使肺炎球菌和其他细菌从鼻腔进入血液。鼻内细胞给药的简单操作和最小侵入性是无可争议的优势。然而，鼻腔和全身途径的主要缺点是缺乏对神经系统内细胞生物分布的控制。此外，值得一提的是，鼻腔内应用细胞后，可能会出现炎症反应、鼻咽粘膜损伤和过敏反应等不良反应。鼻腔给药也可以避免在外周器官中沉积过多细胞的风险。然而它们渗入大脑的机制和给药细胞的确切命运尚未得到充分解释，因此在安全性和有效性方面尚未得到验证。系统性和动脉内给药细胞是目前使用干细胞移植治疗中枢神经系统疾病最常用的技术。与它们的使用相关的一个主要问题是，移植的细胞必须离开血管床才能进入受疾病影响的大脑。这一过程受到重要的BB特殊屏障的阻碍，如BBB、血脑脊液屏障和血脑膜屏障、血软脑膜屏障。它们的作用是保护中枢神经系统结构免受血液中可能存在的潜在有害物质的渗透。在生理状态下，这些屏障的存在阻止了细胞进入脑实质。然而，为了应对损伤，一些免疫系统细胞，如白细胞，获得了通过上述屏障的能力。这个过程被称为血细胞渗出。

在体外，主要通过分析细胞通过transwell腔的膜孔或伤口愈合-划痕试验的转移来研究参与MSC迁移的分子信号通路。大多数研究调查了趋化剂对骨髓间充质干细胞迁移率的影响，如含有高浓度胎牛血清（FBS）的培养基。部分研究选择了刺激MSC迁移的生长因子，包括转化生长因子（TGF）- 成纤维细胞生长因子（FGF）家族成员、血小板衍生生长因子、P物质、SDF-1、VEGF-C、促炎细胞因子，如干扰素（INF）-, IL-1. 研究还表明，骨髓间充质干细胞可以通过自分泌信号刺激其迁移。这些分子激活骨髓间充质干细胞表面的相应受体。与转化生长因子的相互作用- 通过1型受体发生，导致典型和非典型信号转导途径的激活。VEGF-C与VEGFR-2和VEGFR-3受体结合，而SDF-1与趋化因子受体（CXCR）4或CXCR7结合。INF- 提供鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）受体激活。自分泌信号刺激CXCR4受体和水通道蛋白1（AQP1）。此外，在迁移过程中，检测到Ca2+渗透压电1通道的激活。细胞内激酶完成进一步的信号传播。在细胞分裂过程中，一些参与MSC迁移的信号通路通常被其他细胞用于细胞骨架重塑。它们开始于小鸟嘌呤三磷酸酶（GTPases）的激活，如Ras同源基因家族（Rho）和细胞分裂控制蛋白42同源物（Cdc42），其影响蛋白构成Rho相关蛋白激酶或mDia1。其他在MSC迁移中起作用的激酶包括PI3K Akt（磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）、ERK1/2（细胞外信号调节激酶1/2）、FAK（粘着斑激酶）、p38 MAPK（p38丝裂原激活蛋白激酶）、Jak/Stat（Janus激酶/信号转导子和转录激活蛋白）、PYK2（富含脯氨酸的酪氨酸激酶2）、MEK/ERK（丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶）和神经酰胺激酶。文献中特别关注p38 MAPK激酶在MSC迁移中的作用，其抑制作用被证明显著减少体外培养MSC的移动（72–87%）这种信号的激活导致细胞骨架肌动蛋白和肌球蛋白片段的重组和应力纤维的形成，从而产生局灶性粘连和细胞的运动表面。这一过程通常伴随着粘附蛋白和整合素等受体表达的增加v淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）和CXCR4。另一种类型的MSC迁移调节因子是长非编码（核糖核酸）RNA。末端分化诱导lncRNA（TINCR）TINCR/mir-761/Wnt2轴表明TINCR是细胞向化学吸引物移动的诱导剂。TINCR负责海绵，从而使调节Wnt2表达的mir-761失活。在TINCR过度表达的MSC中，观察到迁移增强，伴随Wnt2高指示和Wnt2水平升高-连环蛋白和CXCR4基因表达水平。MSC迁移控制的一个令人兴奋的方面与转录后蛋白质变化有关。在MSC暴露于bFGF后，高迁移率组1A（HMGA1）和HMGA2表达升高。这导致负责核心岩藻糖基化（FUS8）的酶水平升高减少参与核心岩藻糖基化水解的蛋白质，如a-l-岩藻糖苷酶1（FUCA1）它提供了MSC中膜相关蛋白的转录后修饰的变化，包括高唾液酸化和糖基化。由于这些转录后改变是有效配体选择结合所必需的，bFGF治疗具有改善MSC在活化内皮上滚动的潜力骨髓间充质干细胞是经历N-糖基化和岩藻糖基化的主要粘附蛋白家族之一，是整合素。一项研究揭示了转录后蛋白质修饰的重要性，其中FUS8的抑制限制了注射到斑马鱼胚胎中的骨髓间充质干细胞的分散，并限制了它们在小鼠体内向受损骨骼的迁移。尽管以前的体外研究已经提供了很多关于MSC迁移机制的分子基础的有价值的信息，但它们不能完全解释体内发生的现象。

骨髓间充质干细胞通常通过血管系统移植，这意味着移植的细胞必须穿过血管壁才能进入受损结构。骨髓间充质干细胞的迁移和外渗过程尚不清楚。很少有论文描述其阶段，似乎类似于白细胞渗出（图2）。人们认为，停止在损伤区域系统性给予MSC的第一步可能是被动现象。这可能是由于给药细胞体积相对较大，堵塞了毛细血管等小直径血管的管腔。然而，趋化分子受体如CXCR4（CXC 4家族趋化因子受体；CXC趋化因子受体类型4）存在于MSC表面。还存在来自CC亚家族趋化因子结合组（CCR；具有CC基序的趋化因子受体；CC趋化因子受体）的受体，其可介导全身给药细胞向损伤区域的靶向迁移和募集过程。CCR2蛋白在静脉给药的骨髓间充质干细胞向受损心肌迁移中的重要性，以及CXCR4受体及其SDF-1配体相互作用在低氧发作后指导动物大脑细胞运动中的作用，到目前为止已有文献记载。不幸的是，除了单一的例子，趋化过程对全身给药细胞特定器官的作用尚未得到充分验证。当MSC进入靶区时，这些细胞将在靶区进行迁移，它们停止。然而，它们的表面没有选择素，因此它们的对接机制不同于在白细胞中观察到的对接机制。骨髓间充质干细胞的特征是CD44蛋白的高表达，CD44蛋白是一种重要的选择素配体，尽管由于缺乏岩藻糖基化，它没有功能。因此，假设细胞从血流中摄取的现象是一个活跃的过程，那么从血管床迁移到组织的过程必须有不同的分子基础。整合素与免疫球蛋白家族受体的相互作用也被指出，在白细胞中可能是参与细胞滚动替代机制的蛋白质。整合素亚单位，如1.2.1.2.3.5.六,及骨髓间充质干细胞表面存在V。文献中关于4子单位影响数据。Zuk、Orciani和Pittenger指出，骨髓间充质干细胞不表达4亚单位。其他作者说，这种蛋白存在，并通过与血管细胞粘附分子1（VCAM-1）受体相互作用，积极参与骨髓间充质干细胞与内皮细胞的粘附。一些研究表明4骨髓间充质干细胞上的蛋白质可能取决于细胞分离的来源。对于从骨髓获得的MSC，其表达水平不足以与VCAM-1功能性结合。骨髓间充质干细胞表达4亚单位，根据不同作者发表的研究结果，从0.5%到48%不等。观察到差异的原因可能与MSC细胞周期的不同阶段、供体依赖的异质性以及体外培养条件的差异有关，如对粘附蛋白表达有重大影响的氧水平或细胞密度。迄今为止，已经发现1亚单位在建立流动MSC和内皮细胞之间的接触中起着重要作用。使用特异性阻断内皮细胞上存在的整合素或VCAM-1蛋白的抗菌素可减少保留的细胞数量，并限制其向体内受损心肌的迁移。这表明这些受体参与了控制骨髓间充质干细胞从血液中摄取的机制。然而，对于其他整合素在启动骨髓间充质干细胞与内皮层接触中的重要性知之甚少。对于白细胞而言，将LFA-1和极晚抗原-4（VLA-4）等受体与其配体结合是与内皮细胞建立稳定连接的关键。先前的研究表明，在MSCs开始与内皮细胞接触后，在MSCs的细胞质内发生极化。这种现象的发生是由于上述CC趋化因子受体（CCR）受体的激活。该受体的细胞质末端与一种称为FROUNT的适配蛋白相关，该适配蛋白触发PI3K磷脂酶信号级联。它导致细胞骨架的重组，并诱导干细胞产生突起。上述机制首先在单核细胞的趋化性中被描述，然后在MSC迁移到受损心肌的过程中被识别。骨髓间充质干细胞在与内皮层结合后与内皮细胞紧密接触，导致内皮层紧密连接的缺失。除了白细胞的内皮传递机制外，如准细胞和跨细胞途径，一种称为血管造粒的替代方法已经被提出用于骨髓间充质干细胞。与白细胞渗出不同，血管造粒症是内皮细胞主动将被动MSC从光线转移到血管壁外侧的过程。

在此过程中，运输的细胞保持其圆形。此外，这一现象使细胞能够成组转移。基于对骨髓间充质干细胞在体外通过内皮细胞层的观察，还提出了一种模型。骨髓间充质干细胞不沿血管迁移，而是被一个对接结构包围，然后在多个方向产生囊泡投射。由于这些结构，骨髓间充质干细胞遇到内皮细胞，并通过内皮细胞之间未密封的紧密连接穿过内皮细胞层，或穿过其细胞质。这一过程类似于转移性肿瘤细胞和生殖细胞的外渗，而不是白细胞的渗出。骨髓间充质干细胞通过细胞旁途径通过内皮细胞似乎依赖于PI3K激酶活性，因为其阻断抑制细胞迁移；然而，在这个过程中，个体受体之间的相互作用尚未被描述。在致力于骨髓间充质干细胞核膜成分对迁移影响的研究工作中，提出了一个非常有趣的假设。研究人员表明，MSC在体外的迁移率低于其他中胚层细胞类型。在transwell迁移试验中，观察到MSC迁移的开始。然而，当细胞体的大细胞质部分已经通过膜孔时，大多数细胞仍然堆积在舞台上，但细胞核仍然留在后面。进一步的研究表明，MSC具有不规则组织的核膜蛋白，如层粘连蛋白A/C，使细胞核容易起皱。此外，与其他中胚层细胞相比，层粘连蛋白A和层粘连蛋白B1的比例是非典型的。这些细胞核特征可能导致骨髓间充质干细胞移植成功率较低。细胞迁移路径上的另一个障碍是血管基膜，血管基膜的穿过需要蛋白水解酶消化其成分。体外研究表明，骨髓间充质干细胞可以侵入人工基底膜模型，而金属蛋白酶2在这一过程中起着关键作用。阻断基质金属蛋白酶（MMP）2的表达已被证明可将通过细胞外基质蛋白包裹的迁移室迁移的MSC数量减少70%。据一些研究人员称，骨髓间充质干细胞产生MMP-2，而第二大白细胞分泌金属蛋白酶MMP-9未被检测到。另一种似乎在骨髓间充质干细胞迁移过程中起重要作用的蛋白水解酶是尿激酶，在体外通过内皮层的过程中，在这些细胞的附属物中已被识别。然而，这些蛋白酶在骨髓间充质干细胞迁移过程中的重要性尚未在体内研究中得到证实。在目前的文献中，我们发现越来越多的文献表明，血管周围空间可能是成年CNS区域内移植MSC的目的地。还可以找到有关将血管内给药的MSC整合到血管壁的信息，可能是通过它们整合到内皮细胞层。根据文献报道，骨髓间充质干细胞通过内皮细胞迁移所需的时间分别为120分钟、240分钟、24小时或72小时。诱导细胞从血管腔向血管周围空间迁移的可能原因之一可能是由于阻塞的微血管中的低氧水平导致大部分细胞死亡。根据表明氧水平、整合素表达和骨髓间充质干细胞迁移能力之间关系的发现，这一假设似乎是可能的。Choi等人表明，在缺氧条件下，HIF-1 易位至MSCs细胞核，导致整合素亚单位α4整合素表达减少，进而导致MSC向趋化因子迁移增强和MMP2表达增加。这种现象可能导致骨髓间充质干细胞迁移过程的启动。血管周围空间由周细胞居住，MSC与周细胞共享相似的表面抗原（CD146+，CD34−,CD45−,CD56−) 以及分化为成骨细胞和软骨细胞的能力。MSC和周围细胞的这些和其他一致的特征导致了它们共同起源的假设。在文献中，我们可以发现，在原生小鼠和人脑的血管周围空间中，可以识别出具有MSC特征的细胞，这表明表明血管周围空间是MSCs在大脑中的自然生态位。从这个位置MSCs可以积极发挥神经保护和免疫调节作用，并通过旁分泌活动、细胞外小泡释放或纤毛延伸诱导神经血管单位再生。

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